The heme biosynthetic enzyme coproporphyrinogen III oxidase and the heme chaperone HemW from bacteria

Mingers, Toni, Maren

doi:10.24355/dbbs.084-202101141109-0

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The heme biosynthetic enzyme coproporphyrinogen III oxidase and the heme chaperone HemW from bacteria

English
German

The thesis focused on a novel enzyme of heme biosynthesis (YtpQ) and the first cytoplasmic heme chaperone HemW.
The putative coproporphyrinogen III oxidase YtpQ from Bacillus megaterium was recombinantly produced. Subsequent analysis of its enzymatic activity revealed that YtpQ is a true coproporphyrinogen III oxidase converting coproporphyrinogen III to coproporphyrin III. YtpQ is able to catalyzes this reaction in the absence of oxygen using menadione as an alternative electron acceptor potentially linking this step of heme biosynthesis to the respiratory chain. Additionally, it was shown that FAD serves as an cofactor for YtpQ. Kinetic analysis of YtpQ resulted in a KM of 7.9 µmol/L and a kcat of 0.895 min-1. In summary, it was shown that YtpQ from the Gram-positive bacterium B. megaterium is an oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase representing an anaerobe alternative to CgoX during the recently described coproporphyrin-dependent heme b biosynthesis.
The heme chaperone HemW from Escherichia coli was functionally characterized. Growth behavior analysis showed a slight phenotype of a hemW deletion mutant strain during anaerobic growth. In order to get further insight into the influence of HemW´s [4Fe-4S] cluster a HemW iron-sulfur cluster deficient variant was generated. A gel permeation chromatography of HemW and the iron-sulfur cluster deficient HemW variant clearly demonstrated that the iron-sulfur cluster is required for dimerization. However, the iron-sulfur cluster was not essential for heme binding as demonstrated via UV-Vis spectroscopy and heme staining. Using the bacterial adenylate cyclase-based two-hybrid system bacterioferritins BfrA and BfrB as well as E. coli nitrate reductase (NarGHI) subunit NarI were identified as HemW interaction partners. A subsequent heme transfer assay using heme deficient NarGHI containing membrane vesicles clearly showed the ability of HemW to transfer bound heme to its target NarI and to restore NarGHI activity. This was not true for the iron-sulfur cluster deficient variant. In conclusion it was demonstrated that HemW serves as a heme chaperone navigating heme from the heme-binding protein bacterioferritin to the heme enzyme nitrate reductase. The presence of the iron sulfur cluster influences HemW dimerization and heme transfer to target proteins but does not influence HemW´s heme binding ability. The potential involvement of a radical SAM mechanism remains to be determined.

Diese Arbeit beinhaltet zum einen die Charakterisierung eines neuartigen Häm-Biosynthese Enzyms (YtpQ) sowie die Charakterisierung des zytoplasmatischen Häm Chaperons HemW. Die potenzielle Coproporphyrinogen III Oxidase YtpQ aus Bacillus megaterium wurde rekombinant produziert. Die folgende Analyse der enzymatischen Aktivität zeigte, dass YtpQ in der Lage ist die 6 Elektronen Oxidation von Coproporphyrinogen III zu Coproporphyrin III zu katalysieren. Unter anaeroben Bedingungen nutzt YtpQ Menadione als alternativen Elektronenakzeptor. Somit könnte die YtpQ katalysierte Oxidation von Coproporphyrinogen III mit der Atmungskette gekoppelt sein. Zudem wurde gezeigt, dass FAD als Kofaktor fungiert. Mittels kinetischer Analyse wurde ein KM von 7.9 µmol/L und ein kcat von 0.895 min-1 bestimmt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass YtpQ aus dem Gram-positiven Bakterium B. megaterium eine sauerstoffunabhängige Coproporphyrinogen III Oxidase ist, welche als anaerobe Alternative zu der Coproporphyrinogen III Oxidase CgoX in der Coproporphyrin III abgängigen Häm b Biosynthese agiert. Das Häm-Chaperon HemW aus Escherichia coli wurde funktional charakterisiert. Initiale Wachstumsanalysen zeigten die Ausprägung eines Phänotypus eines hemW Deletionsmutantenstammes unter anaeroben Bedingungen. Zur Analyse des [4Fe-4S] Clusters ist eine Eisen-Schwefel Cluster freie Proteinvariante erstellt worden. Eine Gel Permeation Chromatographie von HemW und der [4Fe-4S] Cluster freien HemW Variante zeigte die Abhängigkeit des Clusters zur Dimerisierung. Dahingegen gezeigt werden, dass die Abwesenheit des Clusters die Häm Bindefähigkeit von HemW nicht beeinflusst. Mit Hilfe eines bakteriellen Adenylatzyklase basierenden zwei Hybrid Systems wurden die Bakterioferritine BfrA und BfrB sowie die E. coli Nitratreduktase (NarGHI) Untereinheit NarI als Interaktionspartner von HemW identifiziert. In einem Häm Transfer Assay konnte eindeutig gezeigt werden, dass HemW in der Lage ist gebundenes Häm auf das Target NarI funktional zu übertragen. Dieses war jedoch nicht mit der [4Fe-4S] Cluster freien HemW Variante möglich. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass HemW als Häm Chaperone für den Transfer von Häm bindenden Bakterioferritinen zu dem Häm abhängigen Enzym Nitratreduktase agiert. Zudem beeinflusst das Eisen-Schwefel Cluster die Dimerisierung von HemW sowie den Häm Transfer, jedoch nicht dessen Häm Bindefähigkeit.