Characterization of a new three-component cytochrome P450 system from Thermobifida fusca

Rodriguez Buitrago, Jhon, Alexander

doi:10.24355/dbbs.084-202009280826-0

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Characterization of a new three-component cytochrome P450 system from Thermobifida fusca

English
German

Within this thesis, a new three component cytochrome P450 monooxygenase system from the moderately thermophilic bacterium Thermobifida fusca has been characterized biochemically, structurally and electrochemically. This system comprises the ferredoxin reductase FdR9, the ferredoxin Fdx8 as well as the P450 monooxygenase CYP222A1. Electrochemical characterization of anaerobically purified Fdx8 by Mössbauer spectroscopy, EPR and ICP-MS revealed the presence of a [3Fe–4S]1+-cluster with a histidine residue in place of a cysteine, that is found in [4Fe-4S]-cluster ferredoxins. Mutagenesis of this histidine to cysteine did not yield a [4Fe-4S]-cluster ferredoxin but prevented cluster incorporation. Moreover, cyclic voltammetry of Fdx8 indicated a positive redox potential for this ferredoxin, which is unusual for ferredoxins of P450 systems, but could be due to the presence of the histidine in the coordination region of the cluster. Protein-protein interaction studies of the members of the three-component system using MST, ITC and NMR confirmed binding of Fdx8 to FdR9 and CYP222A1 with KD values of 1 and 3 µM, respectively. ITC measurements further revealed that Fdx8-CYP222A1 as well as Fdx8-FdR9 binding is driven by hydrogen bonding and hydrophobic interactions. Moreover, thermodynamic parameters ?H and ?S indicated a temperature-dependent interaction for Fdx8-FdR9, which might imply conformational changes during binding. Possible conformational changes were also observed for Fdx8 during binding to CYP222A1 as indicated by protein NMR measurements. Structure determination by X-ray crystallography for all three components of the P450 system was also attempted. Crystals of FdR9 and CYP222A1 could be obtained and structures of both proteins have been determined at 1.90 and 1.85 Å resolution, respectively, using molecular replacement. For Fdx8, however, no crystals could be obtained despite testing many different conditions. SEC-MALS measurements confirmed that Fdx8 is a monomer in solution. Moreover, Fdx8 structure determination was also attempted by protein NMR but was hampered due to the paramagnetic effect of the iron-sulfur cluster of the ferredoxin. Instead, a homology model has been generated. Finally, electron transfer within the three-component P450 system was studied using CO-difference spectroscopy and bioconversions. Unfortunately, investigation of the electron transfer from Fdx8 to CYP222A1 was hampered as no substrate of CYP222A1 could be identified so far.

Innerhalb dieser Arbeit wurde ein neues Drei-Komponenten Cytochrom P450 Monooxy-genasesystem aus dem moderat thermophilen Bakterium Thermobifida fusca biochemisch, strukturell und elektrochemisch charakterisiert. Das System besteht aus der Ferredoxin-reduktase FdR9, dem Ferredoxin Fdx8 sowie der P450 Monooxygenase CYP222A1.
Elektrochemische Charakterisierung von anaerob gereinigtem Fdx8 mittels Mössbauer Spektroskopie, EPR und ICP-MS ergab, dass Fdx8 einen [3Fe–4S]1+-Cluster aufweist mit einem Histidin anstelle eines Cysteinrestes, welcher in [4Fe-4S]-Ferredoxinen vorhanden ist. Mutagenese des Histidins zu Cystein führte allerdings nicht zum Einbau eines [4Fe-4S]-Clusters in Fdx8, sondern verhinderte den Einbau des Eisen-Schwefel-Clusters. Darüber hinaus wurde durch Cyclovoltammetrie ein positives Redoxpotential für Fdx8 erhalten. Dies ist ungewöhnlich für Ferredoxine aus Drei-Komponenten P450 Systeme, könnte aber durch Vorhandensein des Histidins in der Nähe zum [3Fe–4S]1+-Cluster beeinflusst sein.
Protein-Protein-Interaktionsstudien aller drei Komponenten mittels MST, ITC und NMR bestätigten eine Bindung von Fdx8 an FdR9 sowie CYP222A1 mit KD-Werten von 1 bzw. 3 µM. Die ITC Messungen ergaben zudem, dass beide Interaktionen durch Wasserstoffbrückenbindungen sowie hydrophobe Interaktionen stabilisiert werden. Darüber hinaus wurden erste Hinweise erhalten, dass sowohl die Interaktion von Fdx8 mit FdR9 als auch die Interaktion von Fdx8 mit CYP222A1 Konformationsänderungen in Fdx8 mit sich bringen. Für alle drei Komponenten des P450 System wurde zudem versucht, deren dreidimensionale Struktur mittels Röntgenstrukturanalyse zu bestimmen. Für FdR9 und CYP222A1 konnten entsprechend Kristalle erhalten und vermessen werden, sowie die Strukturen beider Proteine mit einer Auflösung von 1,90 bzw. 1,85 Å gelöst werden. Für Fdx8 konnten dagegen keine Kristalle erhalten werden und auch die Strukturbestimmung mittels Protein-NMR war aufgrund des paramagnetischen Effektes des Eisen-Schwefel-Clusters nicht möglich. Deshalb wurde stattdessen ein Homologiemodell von Fdx8 erstellt.
Abschließend wurde ebenfalls der Elektronentransfer innerhalb des Drei-Komponenten P450 Systems mittels CO-Differenzspektroskopie sowie Biokatalysen untersucht. Allerdings war der Nachweis einer Elektronenübertragung von Fdx8 auf CYP222A1 nicht möglich, da zuvor kein Substrat der P450 Monooxygenase bekannt war und innerhalb der Arbeit auch kein passendes Substrat identifiziert werden konnte.