Parametrische Untersuchung des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die Barriereeigenschaften von hCMEC/D3 Zellen unter Verwendung eines dynamischen Zellkulturmodells

Um bereits in der frühen Entwicklungsphase die Durchlässigkeit potentieller Wirkstoffe durch die Blut-Hirn-Schranke abschätzen zu können, sind zuverlässige in vitro-Zellkulturmodelle erforderlich. Eine breite Anwendung findet hierbei die humane Zelllinie hCMEC/D3, wobei ihre mäßig restriktiven Barriereeigenschaften einen erheblichen Nachteil darstellen. Eine Erklärung für ihre geringe Barriereintegrität und der hohen Durchlässigkeit für Natriumfluoreszein und FITC-Dextran 4 kDa lieferte die immunzytochemische Untersuchung wichtiger TJ-Proteine. So waren Occludin, ZO-1 und Claudin-5 größtenteils zytosolisch lokalisiert und nicht wie erwartet intramembranös. Hiervon ausgehend wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene statische sowie dynamische Kultivierungsvariationen zur Verbesserung der Barrierefunktionalität analysiert.   Bei der Untersuchung verschiedener Zellkulturmedien stellten sich die Medien ECGM MV-2, MCDB 131 und das serumfreie Medium hESFM neben dem Standardmedium EGM-2 am geeignetsten heraus. Allerdings zeigte keines der untersuchten Medien einen positiven Einfluss auf die endotheliale Barrierewirksamkeit. Auch verschiedene Beschichtungsmaterialien (Laminin, Kollagen, und Fibronektin), Medienzusätzen (Serum, Hydrocortison, Calcium und pCPT-cAMP kombiniert mit Ro-20-1724), Porengrößen (0,4, 1,0, 3,0 µm) und Ko-Kultivierungsvariationen (direkt und indirekt mit SVGmm) verbesserten die Barriereintegrität der hCMEC/D3 Zellen nicht. Zudem wurde der Einfluss einer dynamischen Kultivierung unter Anwendung des Zellkulturmodells DynaMiTES untersucht. Zunächst wurden die Kultivierungsbedingungen erfolgreich an das DynaMiTES-Design angepasst, indem die Aussaatrichtung von normal auf invers geändert wurde. Die Endothelzellen wurden bei einer Flussrate bis 3,33 ml/min für 3 h und bei 0,03 ml/min für 72 h ohne einen Verlust der Zellviabilität und der Zellzahl kultiviert. Jedoch blieben die Barriereeigenschaften der Endothelzellen unter allen untersuchten Flussraten unverändert.

Die Ausbildung dichter Zell-Zell-Kontakte ist eine Voraussetzung für die restriktiven Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die hCMEC/D3 Zelllinie, trotz der getesteten Kultivierungsvariationen, nicht für Permeationsstudien von niedermolekularen Arzneimittelkandidaten geeignet ist. Somit bleibt der Bedarf nach einer Zelllinie mit restriktiven Barriereeigenschaften weiterhin bestehen.