Untersuchungen zum Export, zur Membranassoziation und Aktivität der Phospholipase A PlaB von Legionella pneumophila
L. pneumophila ist ein in wässriger Umgebung vorkommendes Pathogen. Es repliziert intrazellulär in Protozoen, kann jedoch über Inhalation von kontaminiertem Wasser in die humane Lunge gelangen, Makrophagen infizieren und Legionellose auslösen. Zu den Virulenzfaktoren gehört die Phospholipase A (PLA) PlaB. PlaB ist das einzig charakterisierte Mitglied einer neuen PLA-Familie, besitzt sowohl zellassoziierte PLA und Lysophospholipase (LPLA) als auch eine hämolytische Aktivität und ist essentiell für das intrazelluläre Wachstum von L. pneumophila u.a. in RAW Makrophagen. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen zur Sekretion und zur Membranassoziation sowie die Aktivität, das intrazelluläre Wachstum und die Struktur von PlaB untersucht. Mittels BioID-Assays mit massenspektrometrischer Analyse wurden putative bakterielle PlaB-Interaktionspartner im E. coli-Modell und in L. pneumophila identifiziert. Deletionsmutanten von diesen Interaktionspartner sowie von vier spezifisch ausgewählten Legionella-Sekretionssystemen wurden auf Aktivität und Lokalisation von PlaB in E. coli, bzw. L. pneumophila geprüft. Insgesamt wurde bei allen Mutanten keine vollständige Hemmung des Transports und der Aktivität von PlaB gefunden, obwohl es kleinere Effekte gab. Mithilfe eines Koinfektionsassays mit dem L. pneumophila Wildtyp und der plaB-Mutante wurde ein Effekt von PlaB auf das intrazelluläre Wachstum in A. castellanii gefunden. Das Substratspektrum von PlaB wurde durch Aktivitätstest gegen Phosphatidylinositole, die in Zellmembranen vorkommen, ausgeweitet. Zudem wurde eine inhibierende Wirkung durch Zink entdeckt. Zur weiteren Charakterisierung wurde PlaB kristallisiert. In der Kristallstruktur hat das PlaB-Tetramer NAD+/NADH gebunden. Diese Substanz verringerte die Aktivität von PlaB in biochemischen Untersuchungen. Von der Struktur ausgehend, wurden ungewöhnliche Bereiche identifiziert und deletiert, bzw. substituiert. Diese Bereiche enthielten zwei für die PlaB-Struktur einzigartige ß-Faltblätter, einen möglichen Dimerisierungsbereich sowie verschiedene Kationen-Pi-Interaktionspartner. Zur Identifikation der Bereiche wurden PlaB-Mutanten, exprimiert in E. coli, auf ihre Lokalisation und Aktivität untersucht. Es wurde festgestellt, dass die N-terminale Domäne die Phospholipasekerndomäne war und die C-terminale Domäne essentiell für die Aktivität, Substraterkennung und Dimerisierung war. Zudem beeinflusste das spezifische ß-Faltblatt ß9/ß10 die Membranverankerung von PlaB.
L. pneumophila is ubiquitously found in aqueous environments, intracellularly replicating in protozoa. However, the pathogen can enter the human lung via inhalation of contaminated water, infect macrophages and and cause legionellosis. One of the virulence factors of L. pneumophila is the phospholipase A (PLA) PlaB. PlaB is the only characterized member of a new PLA family, has both cell- associated PLA and lysophospholipase (LPLA) as well as hemolytic activity and is essential for intracellular growth of L. pneumophila in, inter alia, RAW macrophages. In this work the mechanisms of secretion and membrane association as well as the activity, intracellular growth and structure of PlaB were investigated. Using BioID assays with mass spectrometric analysis, putative bacterial interaction partners of PlaB were identified in the E. coli model and in L. pneumophila. Deletion mutants of these interaction partners as well as of four specifically selected Legionella secretion systems were tested for activation and localization of PlaB in E. coli and L. pneumophila. However, just minor and major effects on the activity and localization of PlaB were found in the tested mutants. Co-infection assay with L. pneumophila wild-type and the plaB deletion mutant strain show an effect of PlaB on intracellular growth in A. castellanii. The substrate spectrum of PlaB was extended by activity assays against phosphatidylinositols found in cell membranes. In addition, an inhibitory effect of zinc was discovered. In order to characterize the protein, PlaB was crystallized. In the crystal structure, tetramer was found to bind NAD+/NADH. These substances reduced the activity of PlaB in biochemical studies. Based on PlaB structure, unusual regions and special amino acids were identified and deleted or substituted. These areas contained two unique ß-sheets, a possible dimerization area and various cation-pi-interaction-partners. To identify these regions, PlaB mutants expressed in E. coli were examined for their localization and activity. It was found that the N-terminal half was the phospholipase core domain and the C-terminal half was essential for activity and dimerization. In addition, the specific ß-sheet ß9/ß10 was important for membrane anchoring of PlaB.
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