TIRF-Mikroskopische Untersuchungen der Insulin-Granula und des Aktin-Zytoskeletts in primären Beta-Zellen und Untersuchungen des zellulären Energiestoffwechsels mit PercevalHR

Bisherige Untersuchungen von Insulin-Granula wurden meist mit dem Fokus auf fusionierende Granula durchgeführt, indem diese manuell gezählt wurden. Das Aktin-Zytoskelett soll bezüglich der Fusion der Granula eine Doppelrolle einnehmen, sowohl als Barriere als auch als Transportstruktur bei Stimulation. Da die Dynamik des Aktins und der Granula energieabhängig sind, ist es außerdem interessant die dynamische ATP/ADP-Ratio in MIN6- und primären Beta-Zellen zu betrachten. In dieser Arbeit wurde das Verhalten der Insulin-Granula in primären Beta-Zellen aus NMRI-Mäusen mittels TIRF-Mikroskopie betrachtet und Anwender-unabhängig ausgewertet. Außerdem wurden Struktur und Lokalisation des Aktin-Zytoskeletts in Abhängigkeit zu den Insulin-Granula untersucht. Die dynamische Änderung der ATP/ADP-Ratio wurde mit dem PercevalHR-Label bestimmt. Die Insulin-Granula in den Beta-Zellen wiesen eine konstante Bewegung vom Zellinneren zur Plasmamembran und zurück ins Zellinnere auf. Auf diese Weise wurde jedes Granulum im Durchschnitt innerhalb von 25 Sekunden 13,3-mal an der Plasmamembran ausgetauscht. Es war überraschend, dass mit einem 30 mM Glucose-Stimulus keine erhöhten Exozytoseraten in den Beta-Zellen beobachtet werden konnten. Allerdings konnte eine sehr hohe Aktin-Dichte an der gesamten Kontaktfläche zum umströmenden Medium beobachtet werden. Parallele Untersuchung der Granula und des Aktin-Zytoskeletts zeigten eine gegenseitig ausschließende Lokalisation beider zellulärer Strukturen, die in vielen Zellen mit steigender Glucose-Konzentration zunahm. Die Messungen der ATP/ADP-Ratio zeigten beim Wechsel von 0 mM Glucose auf 30 mM Glucose, sowohl in MIN6-Zellen als auch in primären Beta-Zellen eine deutliche Steigerung. Es konnte gezeigt werden, dass einzelne Beta-Zelle kein ideales Modell ist um die Exozytose von Insulin-Granula zu untersuchen, da diese nicht mit insulinotropen Stimuli wie 30 mM Glucose gesteigert werden konnte. Ein möglicher Grund dafür könnte das Aktin-Zytoskelett sein, das in Einzelzellen sehr dichte Strukturen an der Zellmembran ausbildet. Diese dichten Aktin-Strukturen könnten die Insulin-Granula von der Plasmamembran abschirmen und die Exozytose verhindern. Es wäre daher von Vorteil die Exozytose von Insulin-Granula an ganzen Inseln untersuchen zu können. Die dynamische ATP/ADP-Ratio ließ sich mit PercevalHR in MIN6-Zellen und in primären Beta-Zellen bestimmen. Der Verlauf der ATP/ADP-Ratio in primären Beta-Zellen besser reproduzierbar.