Use of phage display technologies for target discovery, antibody generation, and antigen-antibody interaction studies to develop a Listeria spp. detection

Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik
Schmidt Garcia Moreira, Gustavo Marçal

The genus Listeria comprises bacteria that are ubiquitous and commonly present in food production facilities. Even though Listeria monocytogenes is the only Listeria species with relevance in causing listeriosis, many new Listeria species have been described in the recent years increasing the importance of studies over the genus. In this study, phage display technologies were employed to discover, identify, and characterize novel biomarkers and monoclonal antibodies. In brief, antibody phage display was applied to select antibodies against subcellular fractions of L. monocytogenes. Then, the target of the antibodies was identified by ORFeome phage display and confirmed with immunomagnetic separation-mass spectrometry (IMS-MS). Dihydrolipoamide acetyltransferase (pyruvate dehydrogenase complex - enzyme 2, PDC-E2) was identified as the target of the initial antibodies against Listeria spp.. Immunoblot and microscopy showed that this protein is present on the bacterial cell surface and is detectable in fluorescent microscopy. In addition, recombinant antibodies were generated against already known targets (internalins A and B, and fructose bisphosphate aldolase). In total, a set of five scFv-Fc against L. monocytogenes and 22 against Listeria spp. were tested in indirect ELISA against 17 Listeria and 15 non-Listeria species. All the five scFv-Fc against the pathogenic species showed 100 % sensitivity (CI 88.78-100.0 %) and specificity (CI 88.78-100.0 %), while the two anti-fructose bisphosphate aldolase showed non-optimal diagnostic performance. On the other hand, two antibodies against PDC-E2 (anti-Listeria spp.) showed 100 % sensitivity (CI 82.35-100.0 %) and specificity (CI 78.20-100.0 %), confirming PDC-E2 as a suitable detection target for Listeria spp.. Furthermore, the binding regions of two hibridoma-derived antibodies and the scFv-Fc against PDC-E2 were defined via single gene phage display, showing that this technique can provide information over the recognized region of a target in a considerable resolution. In addition, it revealed that the two best anti-PDC-E2 antibodies are the only ones to bind a synthetic region composed of two parts of PDC-E2. Hence, through a particular combination of phage display techniques, the biomarker PDC-E2 and two corresponding scFv-Fc against it, as well as scFv-Fc against internalins A and B, are hereby reported as novel promising tools for Listeria spp. detection.

Die Gattung Listeria umfasst Bakterien, die allgegenwärtig sind und in Lebensmittelproduktionsanlagen häufig vorkommen. Obwohl Listeria monocytogenes die einzige Listeria-Art ist, die für die Entstehung von Listeriosis relevant ist, wurden in den letzten Jahren viele neue Listeria-Arten beschrieben, die die Bedeutung von Studien über die Gattung erhöhen. In dieser Studie wurden Phagen-Display-Technologien eingesetzt, um neuartige Biomarker und monoklonale Antikörper zu entdecken, zu identifizieren und zu charakterisieren. Kurz gesagt, wurde die Antikörper-Phagenanzeige verwendet, um Antikörper gegen subzelluläre Fraktionen von L. monocytogenes auszuwählen. Anschließend wurde das Ziel der Antikörper mittels ORFeome Phagen-Display identifiziert und mit der immunomagnetischen Separationsmassenspektrometrie (IMS-MS) bestätigt. Dihydrolipoamid-Acetyltransferase (Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex - Enzym 2, PDC-E2) wurde als Ziel der ersten Antikörper gegen Listeria spp.. Immunoblot und Mikroskopie zeigten, dass dieses Protein auf der Oberfläche der Bakterienzellen vorhanden ist und in der Fluoreszenzmikroskopie nachweisbar ist. Darüber hinaus wurden rekombinante Antikörper gegen bereits bekannte Targets (Internaline A und B sowie Fructosebisphosphat-Aldolase) gebildet. Insgesamt wurden fünf scFv-Fc gegen L. monocytogenes und 22 gegen Listeria spp. im indirekten ELISA gegen 17 Listerien und 15 Nicht-Listerienarten getestet. Alle fünf scFv-Fc gegen die pathogene Spezies zeigten 100 % Sensitivität (CI 88,78-100,0 %) und Spezifität (CI 88,78-100,0 %), während die beiden Anti-Fruktose-Bisphosphat-Aldolasen eine nicht optimale diagnostische Leistung zeigten. Andererseits zeigten zwei Antikörper gegen PDC-E2 (anti-Listeria spp.) 100 % Sensitivität (CI 82,35-100,0 %) und Spezifität (CI 78,20-100,0 %), was PDC-E2 als geeignetes Nachweisziel für Listeria spp. bestätigt. Darüber hinaus wurden die Bindungsbereiche von zwei aus dem Hibridom stammenden Antikörpern und dem scFv-Fc gegen PDC-E2 über ein einzelnes Genphagen-Display definiert, was zeigt, dass diese Technik Informationen über die erkannte Region eines Ziels in einer beträchtlichen Auflösung liefern kann. Darüber hinaus zeigte sich, dass die beiden besten Anti-PDC-E2-Antikörper die einzigen sind, die eine synthetische Region binden, die aus zwei Teilen von PDC-E2 besteht. Daher werden durch eine besondere Kombination von Phagen-Display Deep Ls, der Biomarker PDC-E2 und zwei entsprechende scFv-Fc dagegen, sowie scFv-Fc gegen Internaline A und B, hiermit als neuartige vielversprechende Werkzeuge für den Listeria spp. Nachweis berichtet.


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