Entwicklung einer API-Produktionsplattform mittels CRISPR/Cas9 auf Basis einer CHO Zelllinie

Der Markt monoklonaler Antikörper (mAb) ist in Bezug auf Vielfalt und Produktionsmenge in den letzten Jahren stark gewachsen [1]. Um die daraus resultierende steigende Nachfrage nach mAbs bedienen zu können, ist es notwendig gute Produktionsplattformen, die den qualitativen Ansprüchen in ausreichender Quantität gerecht werden, für den Markt bereit zu stellen [2]. Diese Dissertation zeigt, wie mit Hilfe der clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) Methode, durch Ausschalten eines Gens der Wirtzelle, eine Produktionsplattform generiert werden kann, mit der es möglich ist therapeutische Proteine in guter Qualität und ausreichender Quantität herzustellen. Die Produktionsleistung der aus dieser Plattform entstandenen Zelllinien kann durch Zugabe von Methotrexat (MTX), einem reversiblen Inhibitor des Enzyms Dihydrofolatreduktase (DHFR), zu dem Zellkulturmedium, gesteigert werden. Die erreichten Produktivitäten der entstandenen Zellklone bewegten sich dabei im dreistelligen Milligramm-Bereich. Die der Produktionsplattform zugrundeliegende Zelllinie wurde genetisch durch den Einsatz der CRISPR-Cas9-Methode so verändert, dass sie nicht in der Lage ist das Enzym DHFR, das eine wichtige Rolle in der DNA Synthese spielt, zu exprimieren. Zelllinien, bei denen das DHFR-Gen ausgeschaltet wurde, können nur durch Zugabe von Hypoxanthin und Thymidin (HT) in das Zellkulturmedium proliferieren. Durch die Verwendung eines DHFR-Gens als Selektionsgen, das an ein gene of interst (GOI) gekoppelt ist, während einer Zelllinienentwicklung, erlangen die Zellen wieder die Fähigkeit ohne den Zusatz von HT zu überleben. Zusätzlich kann durch Zugabe von MTX zu der Zellkultur erreicht werden, dass sich das DHFR und somit auch das daran gekoppelte GOI amplifiziert. Dadurch kann die Produktivität der entstandenen Produktionszellen gesteigert werden. Es wurde gezeigt, dass unterschiedliche Transfektionsansätze bei der Produktivität stark variieren (3.2.4), was z.B. durch die Kopienzahl und den Integrationsort zustande kommen kann. Daher ist es für die Entwicklung eines Hochproduzentenzellklons zu empfehlen möglichst viele Transfektionsansätze durchzuführen und eine große Menge an Klonen zu screenen.