Phänotypische und funktionelle Charakterisierung der Zink-Metalloprotease ProA von Legionella pneumophila

Thiem, Stefanie

doi:10.24355/dbbs.084-201902261044-0

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Phänotypische und funktionelle Charakterisierung der Zink-Metalloprotease ProA von Legionella pneumophila

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Legionella pneumophila ist ein ubiquitär in der Umwelt vorkommendes Bakterium, das sich intrazellulär in Protozoen sowie in humanen alveolaren Makrophagen vermehrt. Durch die Ausbreitung des Bakteriums in der Lunge kann es zu starken Schädigungen des pulmonalen Gewebes kommen, was oft in einer schweren, atypischen Lungenentzündung, der sogenannten Legionärskrankheit, resultiert. Ein wichtiger Virulenzfaktor ist die Zink-Metalloprotease ProA, das am meisten sezernierte Protein von L. pneumophila. Eine Aufschlüsselung der Kristallstruktur erfolgte jedoch bis dato nicht. Auch die Rolle von ProA bei der Vermehrung und Pathogenität von L. pneumophila wurde bislang nicht genau geklärt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte natives ProA erfolgreich isoliert sowie die rekombinante Produktion und Reinigung optimiert werden. Unter Anwendung verschiedener Chromatographie-Methoden wurde rekombinantes ProA mit hohem Reinheitsgrad gewonnen und erste Kristallisationsversuche durchgeführt. Sekretomanalysen zeigten, dass ProA den größten Anteil der extrazellulären Proteaseaktivität von L. pneumophila ausmacht. Weiterhin konnte durch massenspektrometrische Untersuchungen nachgewiesen werden, dass, im Vergleich zum Wildtyp, viele sekretorische Proteine im zellfreien Kulturüberstand der proA-defizienten Mutante verringert waren oder nicht vorkamen. Dieses veränderte Sekretom der proA-defizienten Mutante hat möglicherweise Auswirkungen auf die Physiologie von L. pneumophila. Infektionen von A. castellanii, V. vermiformis und THP-1-Makrophagen ergaben eine Rolle für ProA in der frühen Phase der Infektion sowie der intrazellulären Replikation. ProA hat weiterhin einen Einfluss auf die Vermehrung von L. pneumophila in humanen Lungengewebsexplantaten (HLTEs) und ist hauptverantwortlich für die Schädigung des Gewebes. In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass ProA monomeres Flagellin (FlaA) degradiert und so die Flagellin-vermittelte TLR5-Aktivierung, sowohl bei hTLR5 exprimierenden HEK-Zellen als auch bei Infektion von HLTEs mit L. pneumophila, verhindert. Weiterhin wird ein Einfluss auf die CXCL8-Produktion im Gewebe vermutet.

Legionella pneumophila is an ubiquitous, environmental bacterium which proliferates intracellulary within protozoa as well as in human alveolar macrophages. The spread of the bacterium in the lung can cause damage to the pulmonary tissue, often resulting in severe, atypical pneumonia, the so-called Legionnaires' disease. An important virulence factor is the zinc metalloprotease ProA, the most secreted protein of L. pneumophila. The crystal structure of ProA has not been elucidated so far. Also, the role of ProA in proliferation and pathogenicity of L. pneumophila has not been fully clarified. In the context of this work, native ProA was successfully isolated and the recombinant production and purification were optimized. Using various chromatographic methods, recombinant ProA was recovered with high degree of purity and first crystallization assays were performed. Secretome analysis showed that ProA has the largest contribution to the extracellular protease activity of L. pneumophila. Furthermore mass spectrometric analysis revealed that, compared to the wildtype, many secretory proteins were reduced or not present in the cell-free culture supernatant of the proA-deficient mutant. This altered secretome of the proA-deficient mutant may affect the physiology of L. pneumophila. Infections of A. castellanii, V. vermiformis and THP-1 macrophages showed, that ProA is important for the early stages of host infection as well as intracellular replication. Furthermore, ProA influences the proliferation of L. pneumophila in human lung tissue explants (HLTEs) and is primarily responsible for the tissue damage. It could be further shown, that ProA degrades monomeric flagellin (FlaA). Thus, ProA prevents flagellin-mediated TLR5-activation both in hTLR5-expressing HEK cells and in HLTE infection with L. pneumophila. An influence of ProA on the CXCL8 production in tissue is suspected.