Closing the gap: Measuring Identical Distances by Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule FRET

In der Fluoreszenzmikroskopie können Abstandsmessungen und strukturelle Untersuchungen im Bereich zwischen 1 nm und 10 nm mittels strahlungsloser Energieübertragung zwischen einem Donor- und einem Akzeptormolekül durchgeführt werden. Diese Methode (Förster Resonanz Energie Transfer, kurz FRET) ermöglicht die Betrachtung dynamischer Vorgänge und struktureller Eigenschaften von biomolekularen Komplexen. Die Bestimmung von absoluten Abständen wird durch diverse Einflussfaktoren auf die FRET-Effizienz begrenzt. Die Superauflösungsmikroskopie erlaubt aber die Vermessung der absoluten Distanz zwischen zwei Punktlichtquellen. Durch die fortschreitende Weiterentwicklung der DNA-PAINTMethode, die auf dem transienten Binden von Fluoreszenzfarbstoffen sowie deren präziser Lokalisation beruht, ist die exakte Darstellung von Abständen im Bereich von 1 nm - 10 nm möglich und kann erstmals in Korrelation mit FRET-Ergebnissen gebracht werden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgt der Vergleich beider Messmethoden am gleichen biologischen Objekt, um abstandsbestimmende Experimente durchzuführen. Als Referenz dienen selbstassemblierende DNA-Origami Nanostrukturen, auf denen Fluoreszenzsfarbstoffe präzise positioniert werden. Drei Abstände wurden jeweils mit DNA-PAINT und FRET vermessen. Zur Etablierung beider Methoden an einem für die Superauflösungsmikroskopie ausgelegten Messaufbau erfolgten die Untersuchungen auf jeweils entsprechend konzipierten DNA-Origami Nanostrukturen. Die qualitative Durchführung von FRET und DNA-PAINT am gleichen Messaufbau ist in dieser Arbeit gezeigt und kann für zukünftige Anwendungen optimiert werden. Eine quantitative Analyse der FRET-Ergebnisse wurde an einem etablierten konfokalen Mikroskop realisiert, wodurch die Rückführbarkeit auf die Superauflösung bestätigt werden konnte. Durch das erreichte Auflösungsvermögen der DNA-PAINT Methode (<10 nm) wird ihre Anwendbarkeit zur strukturellen Analyse eines einzelnen Proteins in dieser Arbeit überprüft. DNA-Origami Nanostrukturen wurden eingesetzt, um das Protein gerichtet und planar auf diesen zu immobilisieren. So können definierte Bereiche gezielt durch die Superauflösungsmikroskopie abgebildet werden. Das hier untersuchte archaeelle HFQ-ähnliche Protein, das wichtige Aufgaben bei der Genregulation übernimmt, ist mit den Nanostrukturen verbunden und mittels DNA-PAINT vermessen worden. Dabei konnte dessen native Struktur sowie Abstände zwischen definierten Bereichen wiedergegeben werden.