Efficient expression of viral surface proteins by transient gene expression in Hi5 insect cells for functional and structural analysis
Viral surface proteins are key players in virus - host interactions. Hence, their recombinant production for structural and functional analyses is an important step for vaccination and structure-based drug design. This PhD thesis addresses the expression and purification of Influenza A (IAV) and Hepatitis C virus (HCV) surface proteins. Their surface proteins hemagglutinin (HA) and E2 are important targets for the generation of new antigens for vaccination. Besides, the investigation of their structure and function relations are a major task in structure-based drug design. Thus, a method was developed for recombinant expression and purification of HA and E2 variants for functional and structural analysis. In the first part of this thesis, a method was developed for secretory expression of the full-length ectodomain of the two IAV HA subtypes circulating in human, H1 and H3, in its uncleaved prefusion state for structural investigation of HA activation. Hi5 insect cells were discovered to be the most suitable expression host for the production of these HA precursors with an intact, nonmodified cleavage loop. Moreover, a protocol was established for HA expression up-scaling that was reliable, economic, easy to handle, comparatively fast and accessible for a scale-up in bioreactor dimensions. All in all, the production process and its optimized downstream processing resulted in very pure protein of high-quality. In the second part, a strategy for effective expression of recombinant secreted E2 ectodomain variants via transient gene expression (TGE) in Hi5 insect cells was established. Subsequently, an efficient downstream processing was established and the whole production process was optimized resulting in higher protein titers. The different soluble E2 variants were subsequently applied to biochemical analysis, in vitro assays and vaccination studies for further analysis of their structure and function. The recombinant sE2 variants were found to inhibit HCV infection in in vitro inhibition assays and to induce the production of E2-specific antibodies in mice, indicating proper folding and functionality. Among the different expression systems evaluated in the course of this thesis the TGE in Hi5 insect cells pointed out to be advantageous for the expression of the desired viral surface proteins. This recently established method not only allows the fast expression analysis of different constructs, but is also very successful for process up-scaling.
Virale Oberflächenproteine spielen eine entscheidende Rolle in der Infektionsforschung, da sie an vielen wichtigen Funktionen in der Wechselwirkung zwischen dem Virus und dem Wirt beteiligt sind. Ihre rekombinante Expression für strukturelle und funktionelle Analysen ist daher sowohl in der Impfstoffentwicklung als auch in der strukturbasierten Wirkstoffforschung ein wichtiger Prozess. Diese Doktorarbeit widmet sich daher der Expression von biologisch aktiven Oberflächenproteinen des Influenza A (IAV) und Hepatitis C Virus (HCV). Ihre Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA) und E2 sind wichtige Angriffspunkte für die Herstellung neuer Antigene in der Impfstoffentwicklung. Darüber hinaus ist die Untersuchung ihrer Struktur- und Funktionsbeziehungen wichtiger Bestandteil der strukturbasierten Wirkstoffforschung. Für diesen Zweck wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit ein Verfahren für die effiziente rekombinante Expression und Reinigung der Oberflächenproteine HA und E2 entwickelt. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der sekretorischen Expression der Ektodomäne der human-pathogenen HA Subtypen H1 und H3 in ihrer ungespaltenen, inaktiven Form für strukturelle Analysen der HA Aktivierung. Hierbei hat sich herausgestellt, dass eine Expression in Hi5 Insektenzellen am besten für die Kristallisierungsanalysen geeignet ist. Außerdem wurde ein Protokoll für ein Scale-Up der HA Produktion entwickelt, das bis zur Produktion im Bioreaktormaßstab geeignet ist. Insgesamt wurde sowohl der HA Produktionsprozess als auch dessen Weiterverarbeitung in der Art optimiert, dass reines Protein von hoher Qualität gewonnen werden konnte. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer effizienten Strategie zur sekretorischen Expression von rekombinanten Varianten der E2 Ektododomäne, wobei sich die transiente Genexpression (TGE) in Hi5 Insektenzellen als besonders geeignet herausgestellt hat. Zudem wurde ein geeignetes Verfahren für das Downstream Processing etabliert und weiter optimiert. Des Weiteren wurden biochemische Analysen, in vitro Assays und Vakzinierungsversuche durchgeführt, die erste Hinweise auf ihre Funktionalität geben. Alles in allem hat sich die TGE in Hi5 Insektenzellen als vorteilhaft für die rekombinante Expression der gewünschten Oberflächenproteine gezeigt, da diese Methode nicht nur eine schnelle Expressionsanalyse verschiedener Konstrukte ermöglicht, sondern auch sehr effizient im Rahmen eines Scale-Ups eingesetzt werden kann.
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