Novel in vitro and in vivo models of Kaposi’s sarcoma for investigation of viral maintenance and validation of antiviral compounds

Dubich, Tatyana

doi:10.24355/dbbs.084-201812051247-0

Published

Novel in vitro and in vivo models of Kaposi’s sarcoma for investigation of viral maintenance and validation of antiviral compounds

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Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is the etiological agent of Kaposi’s sarcoma (KS), a tumor of endothelial origin predominantly affecting immunosuppressed individuals. Up to date, vaccines and targeted therapies are not available. Screening and identification of antiviral compounds are compromised by the lack of scalable cell culture systems reflecting properties of virus transformed cells in patients. Further, the strict specificity of the virus for humans limits the development of in vivo models. In this study conditionally immortalized human endothelial HuARLT cells were validated as a system to study KSHV-induced pathogenesis and testing of novel antiviral drugs. Systematic analysis of cellular marker expression as well as cellular functions in 2D and 3D cell culture conditions showed that HuARLT cells closely mimic KSHV infection of primary cells. A humanized mouse model for KSHV based on the cell line develop lesions which histologically resemble KS. Importantly, invasive properties and tumor formation were completely reverted by purging cells from KSHV confirming for the first time that tumor formation is primarily dependent on viral infection, rather than being a consequence of irreversible transformation of the infected cells. The cell line was used to investigate the molecular mechanisms of KSHV maintenance in endothelial cells. This study proved that lack of cell proliferation is not sufficient to maintain the episomal virus, as was believed before. Rather, it demonstrated that 3D culture conditions (in vitro or in vivo) are required for efficient viral maintenance. Transcriptome analysis and pharmacological studies showed that increased activity of the PI3K/mTOR pathway governs viral maintenance in 3D cell culture. A subset of 26 compounds from a natural compound library was screened for reducing the episomal viral copy number and the tumorigenic properties of KSHV-infected cells in 2D and 3D in vitro cell culture systems. Selected compounds were subsequently tested for the ability to reduce the tumor size in xenotransplanted mice. Based on the assay three drug candidates showed significant tumor reduction. Thus, this study shows that the combined use of antiviral and antitumor assays based on the same cell system is indicative for tumor reduction in vivo and therefore allows faithful selection of novel drug candidates against Kaposi’s sarcoma.

Das Kaposi-Sarkom assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist ein humanspezifischer Krankheitserreger, der zur Bildung von Kaposi-Sarkomen (KS) führt. Bis heute gibt es keine Impfstoffe und keine gezielte Therapie gegen KS. Die Identifizierung von antiviralen Substanzen wird dadurch erschwert, dass es keine skalierbaren Zellkultursysteme gibt, die die Eigenschaften der Virus-transformierten Patientenzellen widerspiegeln. Weiterhin verhindert der enge Wirtstropismus die Entwicklung von in vivo Modellsystemen. In der vorliegenden Studie wurden konditional immortalisierte humane HuARLT-Endothelzellen zur Untersuchung der durch KSHV ausgelösten Pathogenese sowie für die Testung neuer antiviraler Substanzen validiert. Die systematische Analyse der KSHV-infizierten HuARLT-Zellen unter 2D- und 3D- Kultur¬bedingungen zeigte, dass sie die Eigenschaften und Funktionen von infizierten primären Zellen sehr gut reflektieren. Ein durch Xenotransplantation der infizierten Zellen generiertes humanisiertes Mausmodell zeigte die Ausbildung von Läsionen, deren histologische Charakterisierung große Übereinstimmung mit KS aufwies. Die Zelllinie wurde eingesetzt, um die molekularen Mechanismen des Erhalts des Virus in Endothelzellen zu untersuchen. Dies zeigte, dass die Unterbindung der Zellproliferation nicht ausreicht, um den in vitro beobachteten Verlust des episomalen Virusgenoms zu verhindern, wodurch eine langjährige Hypothese widerlegt ist. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass 3D-Kulturbedingungen (in vitro, aber auch in vivo) die Erhaltung des Virus unterstützen. Transkriptomanalysen und begleitende Inhibitionsstudien deckten auf, dass der PI3K/mTor-Signalweg essentiell für den Erhalt des Virus in 3D Zellkultur ist. Aus einer Wirkstoffbank wurden 26 Moleküle in vitro in 2D und 3D Zellkultursystemen bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, die Zahl der episomalen Virusgenome sowie die tumorigenen Eigenschaften der KSHV-infizierten Zellen zu reduzieren. Ausgewählte Wirkstoffe wurden dann bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die virusinduzierten Läsionen im Mausmodell zu verringern. Drei neue Wirkstoffkandidaten schränkten das Tumorwachstum im Mausmodell signifikant ein. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass der kombinierte Einsatz der in dieser Arbeit entwickelten Nachweissysteme es erlaubt, die Viruspathogenese zu untersuchen und auch antivirale und antitumorigene Wirkstoffe zu identifizieren, die die Tumorbildung in vivo mit hoher Effizienz reduzieren. Somit bieten sich diese Testsysteme für die Wirkstoffsuche gegen KS an.