Ganzgenom-basierte Analysen multiresistenter Klebsiella pneumoniae-Isolate aus Deutschland

Becker, Laura, Antonia

doi:10.24355/dbbs.084-201810020953-0

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Ganzgenom-basierte Analysen multiresistenter Klebsiella pneumoniae-Isolate aus Deutschland

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Die vorliegende Arbeit widmet sich der Ganzgenom-basierten Analyse ESBL- und Carbapenemase-produzierender K. pneumoniae-Isolate aus Deutschland. Im ersten Teilprojekt konnte durch Kombination von PacBio- und Illumina Miseq-Sequenzierung die Genomsequenz (Chromosom und drei Plasmide: 3,8kb, 4,8kb und 362kb) des CTX-M-15-produzierenden K. pneumoniae-Isolats 234/12 (ST514) rekonstruiert werden. Das Isolat 234/12 wurde im zweiten Schritt verwendet, um den Einfluss des DNA-Extraktionskits auf die anschließende Miseq-Sequenzierung zu untersuchen. Während die Wahl des Kits kaum Einfluss auf die Qualität der Sequenzierung und die Coverage von Chromosom und 362kb-Plasmid hatte, fiel die Coverage der kleinen Plasmide bei Verwendung von salting-out-basierten Kits wesentlich geringer aus als mit Matrix-basierten Kits. Da jedoch mit allen getesteten Kits eine ausreichende Coverage aller Replikons erreicht wurde, kann die Wahl des Kits in Fällen, in denen die beobachteten Unterschiede in der Coverage kleiner Plasmide vernachlässigbar sind, von anderen Faktoren (wie z.B. Kosten und Zeitaufwand) abhängig gemacht werden. Das dritte Teilprojekt widmete sich der Beschreibung der Population Carbapenemase-produzierender K. pneumoniae (KPC-2, KPC-3, OXA-48, NDM-1) in Deutschland (2008-2014). Dazu wurde das Genom von insgesamt 107 Isolaten sequenziert (Illumina Miseq). Die Daten wurden zur Berechnung von Stammbäumen, auch unter Einbeziehung internationaler Isolate, und zur Charakterisierung der Isolate verwendet (Sequenz- und Kapseltyp, Gehalt an Plasmiden, Beta-Laktamase- und Virulenzgenen). Neben erfolgreichen klonalen Linien, wie ST258/ST512, ST101, ST147, ST395 und ST15 zeigten sich auch Isolate, deren Sequenztypen bisher nur selten in Assoziation mit Carbapenemasen beschrieben wurden, wie zwei K. variicola-Isolate (ST347, ST906) und ein OXA-48-produzierendes ST23-Isolat mit einem hohen Gehalt an Virulenzfaktoren. Die Untersuchung eines Ausbruchsgeschehens in einer deutschen Klinik (April 2015 - Mai 2016) bildete das vierte Teilprojekt. Die Ganzgenom-basierte Analyse von 53 Isolaten zeigte das Vorliegen von drei Ausbruchsclustern (K. pneumoniae: ST15, n=31; ST405, n=7 und K. quasipneumoniae: ST414, n=8). Zur Identifizierung weiterer Ausbruchsisolate wurde eine für das Hauptcluster spezifische Triplex-PCR etabliert. Zudem wurden die Ganzgenom-Daten genutzt, um die genetische Ursache für die Carbapenem- bzw. Colistinresistenz von zwei Isolaten des ST15-Clusters zu bestimmen.

The present thesis addresses the whole-genome-based analysis of ESBL- and carbapenemase-producing K. pneumoniae isolates from Germany. Using a combination of PacBio- and Illumina Miseq-sequencing the genome sequence (chromosome and three plasmids: 3.8kb, 4.8kb and 362kb in size) of the CTX-M-15-producing K. pneumoniae isolate 234/12 (ST514) could be reconstructed. In the second step, the isolate 234/12 was used to examine the influence of the DNA extraction kit on the subsequent Miseq sequencing. While the choice of the kit had little effect on the sequencing quality and the sequencing coverage of both the chromosome and the 362 kb plasmid, the coverage of the small plasmids was lower when using salting-out-based kits compared to matrix-based kits. However, since all kits yielded a sufficient coverage of all replicons, in cases where the differential coverage of small plasmids can be neglected, the choice of DNA extraction kit can be made based on other factors (e.g. costs and extraction time). The aim of the third project was the description of the population of carbapenemase-producing K. pneumoniae (KPC-2, KPC-3, OXA-48, NDM-1) in Germany (2008-2014). Therefore, whole genome sequencing of 107 isolates was performed (Illumina Miseq). Data was used for the generation of phylogenetic trees, also taking account of international isolates, and for the characterisation of the isolates (sequence and capsular type, content of plasmids, beta-lactamase and virulence genes). Besides successful clonal lineages, like ST258/ST512, ST101, ST147, ST395 and ST15, some isolates were found to belong to sequence types that have been rarely reported to harbour carbapenemases so far, e.g. two K. variicola isolates (ST347, ST906) and one OXA-48-producing ST23 isolate revealing a high amount of virulence factors. Finally, an outbreak scenario occurring in a German hospital (April 2015 till May 2016) was investigated. The whole-genome-based analysis of 53 isolates revealed the presence of three outbreak clusters (K. pneumoniae: ST15, n=31; ST405, n=7 and K. quasipneumoniae: ST414, n=8). To enable identification of emerging outbreak isolates a triplex PCR specific for the major cluster was established. Furthermore, whole-genome sequence data was used to determine the genetic source of the carbapenem and colistin resistance, respectively, of two ST15 cluster isolates.