Experimental and theoretical analyses of the metabolic role of the 262-kb plasmid in the context of the endogenously produced antibiotic tropodithietic acid in Phaeobacter inhibens DSM 17395

Will, Sabine, Eva

doi:10.24355/dbbs.084-201807251052-0

Published

Experimental and theoretical analyses of the metabolic role of the 262-kb plasmid in the context of the endogenously produced antibiotic tropodithietic acid in Phaeobacter inhibens DSM 17395

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Extrachromosomal elements play a crucial role in adaptation and survival of many marine bacteria in their natural habitat providing essential features and facilitating lateral gene transfer. Phaeobacter inhibens DSM 17395 carries three plasmids with advantageous functions: 65-kb (biofilm, motility), 78-kb (siderophores) and 262-kb (tropodithietic acid). The metabolic role of the 262-kb plasmid of P. inhibens DSM 17395 with a focus on biosynthesis of TDA were studied as part of this thesis applying both, non-targeted GC- and LC-MS based analyses. Experimental data were complemented by in silico analyses with the reconstructed metabolic model iPin571. Deletion of the 262-kb plasmid improved growth efficiency with only minor changes on metabolic level which can be attributed to the pipecolate oxidase-dependent lysine catabolism encoded by the plasmid. Combined metabolomics and transcriptomics showed that the wild-type strain entered stationary growth phase due to the inhibitory effect by its own produced TDA. Sufficient carbon provided by amino acids were still available in the medium. Contrary to that, the ?262-kb plasmid-cured mutant strain was carbon-limited. Detailed analyses indicated the degradation of the storage compound polyhydroxybutanoate to produce a proposed lipoteichoic acid as a response to a starvation triggered phage. A new biosynthetic pathway for TDA was proposed based on metabolome and transcriptome data revealing an unexpected strategy for sulfur incorporation via an episulfide. Furthermore, a methylated (“pre”-) TDA was observed with a proposed associated methyltransferase, encoded on the chromosome, for conversion into TDA. Metabolic model-based analyses showed that growth efficiency for TDA-free cultivations were optimal while TDA biosynthesis decreased biomass yield and increased oxygen consumption. The major drawback is based on the inhibitory effect by the disruption of the proton gradient. Taken together, this study clearly shows that TDA production by P. inhibens DSM 17395 and some closely related strains is an advantage in its natural habitat despite the consequences for its own energy metabolism.

Extrachromosomale Elemente spielen eine essentielle Rolle in der Adaptation und den Überlebensstrategien mariner Bakterien in ihrem natürlichen Habitat und können sich über lateralen Gentransfer zwischen Stämmen verbreiten. Phaeobacter inhibens DSM 17395 besitzt drei Plasmide unterschiedlicher Größe mit relevanten Funktionen: 65-kb (Biofilm, Motilität), 78-kb (Siderophore) und 262-kb (Tropodithietsäure). Die metabolische Funktion des 262-kb Plasmids von P. inhibens DSM 17395 wurde in Bezug auf die Biosynthese von TDA im Rahmen dieser Arbeit untersucht, indem ungezielte GC- und LC-MS basierte Analysen angewendet wurden. Zudem wurde das metabolische Modell iPin571 erstellt und für in silico Analysen genutzt. Die Deletion des 262-kb Plasmids verbesserte die Wachstumseffizienz während nur geringfügige Unterschiede auf Metabolomebene sichtbar waren. Diese Änderungen können im Wesentlichen auf den Plasmid-codierten und Pipecolatoxidase-abhängigen Lysinabbau zurückgeführt werden. Die Kombination von Metabolomics und Transcriptomics zeigte, dass der Wildtyp auf Grund des inhibitorischen Effekts des vom Organismus selbst produzierten TDAs in die stationäre Wachstumsphase übergeht. Im Gegensatz dazu war die ?262-kb Plasmidmutante am Ende der Kultivierung kohlenstofflimitiert. Detaillierte Analysen deuten darauf hin, dass der Speicherstoff Polyhydroxybutanoat abgebaut wurde, um eine Verbindung ähnlich zu Lipoteichonsäuren als Antwort auf einen Phagen zu produzieren, der durch den Nährstoffmangel induziert wurde. Basierend auf Metabolom- und Transkriptomdaten wurde ein neuer Stoffwechselweg für die TDA-Biosynthese mit einem Schwefeleinbau über ein Episulfid postuliert. Außerdem konnte ein methyliertes („Pre“-) TDA beobachtet werden, welches durch eine putative Methyltransferase, die auf dem Chromosom codiert ist, in TDA umgewandelt werden kann. Metabolische, modellbasierte Analysen zeigten, dass die Wachstumseffizienz für TDA-freie Kultivierungen optimal war, während die TDA-Biosynthese die Biomasseausbeute verringerte und den Sauerstoffverbrauch erhöhte. Der größte Effekt basiert dabei auf dem inhibitorischen Effekt durch die Zerstörung des Protonengradienten. Zusammengefasst zeigt dies, dass die Produktion von TDA durch P. inhibens DSM 17395 und einiger nah verwandter Stämme, unabhängig von den Auswirkungen auf den eigenen Energiemetabolismus, einen Vorteil im natürlichen Habitat bietet.