Exploring and Controlling Phenazine Biosynthesis with Chemical and Structural Biology
Phenazines are secondary metabolites of bacterial and archaeal origin. Involved in a variety of redox reactions yielding reactive oxygen species, phenazines exhibit a broad-spectrum antibiotic activity and a high potency as virulence factors. As such, their biosynthesis has been studied extensively in recent years leading to the structural and functional characterization of most enzymes responsible for biosynthesis of the common phenazine scaffold. Yet, some details of the associated reaction mechanisms remained elusive. This study aimed at answering remaining questions about the potentially unique catalytic mechanism of the isomerase PhzF, the role and significance of PhzAB heterodimerization and at the development of PhzB-specific inhibitors. This work contributed to a deeper understanding of the individual steps employed by the isomerase PhzF to convert DHHA, the last stable intermediate of phenazine biosynthesis, to a reactive ketamine. Measurement of kinetic isotope effects lent evidence that initial abstraction of a non-acidic proton is the rate-limiting step of catalysis. Together with computational data, the complete catalytic cycle of this enzyme could be elucidated. It could also be shown that the substrate specificity of PhzF is narrow and one substrate analog revealed weak inhibitory potency, thus constituting a promising starting point for future drug-development studies. Analysis of the catalytic activity of PhzBB homodimers and PhzAB heterodimers using a newly developed enzymatic assay revealed similar efficiency of both dimer forms. Together with thermal stability data from CD-measurements showing that heterodimers are as stable as PhzBB homodimers, these results indicate that PhzAB heterodimers might be prevalent in vivo. This hypothesis is further supported by quantitative RT-PCR data and as such might explain why pseudomonads, which carry genes encoding for PhzA and PhzB, are such efficient phenazine producers. New synthetic compounds derived from substrate or product analogs were characterized regarding their inhibitory potency towards the potential drug target PhzB. To this aim, an in vitro assay was developed and employed for screening of more than 80 compounds. Combining ITC binding data, crystal structures and in cellulo activity data a detailed structure activity relationship could be drawn and potent inhibitors identified.
Phenazine sind kleine, stickstoffhaltige Verbindungen im Primär- und Sekundärmetabolismus von Bakterien und Archaeen. Die physiologischen Eigenschaften dieser Verbindungen beruhen vor allem auf ihrer Redoxaktivität. Gleichzeitig führt diese jedoch zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, was einerseits die unspezifische antibakterielle Wirkung der Phenazine, aber auch deren Rolle als Virulenzfaktoren bei bakteriellen Infektionen erklärt. In den vergangenen Jahren wurden die an der Phenazinbiosynthese beteiligten Enzyme strukturell und funktionell charakterisiert. Jedoch blieben einige mechanistische Details, wie z.B. der potentiell einzigartigen Mechanismus der Isomerase PhzF oder auch die Rolle der Heterodimerisierung von PhzAB in Pseudomonaden ungeklärt. Diese Arbeit soll einen Beitrag zu Beantwortung dieser Fragen liefern und darüber hinaus der Untersuchung und (Weiter-)Entwicklung potentieller PhzB-Inhibitoren dienen. Im Falle der PhzF-katalysierten Umsetzung von DHHA zum reaktiven Aminoketon AOCHC konnten die, in dieser Arbeit gemessenen, kinetischen Isotopeneffekte dazu beitragen die Abspaltung eines nicht-aziden Protons als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Katalyse zu identifizieren. Zusammen mit computergestützten Berechnungen konnte so schließlich der vollständige Katalyse-Zyklus von PhzF aufgeklärt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass PhzF ein enges Substratspektrum besitzt, was die Entwicklung von Inhibitoren basierend auf Substratanaloga ermöglicht. Ein speziell entwickelter enzymatischer Assay erlaubte die Bestimmung der katalytischen Aktivität von PhzBB-Homo- und PhzAB-Heterodimeren. Die Tatsache, dass beide Dimere vergleichbare Aktivitäten im Assay zeigen und die Stabilität von Heterodimeren zudem äquivalent zu PhzBB-Homodimeren ist, erlaubte die Aufstellung der Hypothese, dass PhzAB-Heterodimere die vorrangige Dimerisierungsform in vivo darstellen. Quantitative RT-PCR-Daten scheinen dies zu bestätigen und könnten somit erklären, warum Pseudomonaden besonders potente Phenazinproduzenten darstellen. Weiterhin konnten, auf Basis des neuentwickelten PhzB-Aktvitätsassays, über 80 Verbindungen hinsichtlich ihrer potentiellen Wirksamkeit als PhzB-Inhibitoren charakterisiert werden. Zusammen mit Bindungsmessungen, Kristallstrukturanalysen und in cellulo-Aktivitätstests ermöglichten diese biochemischen Daten eine detaillierte Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehung und somit Identifikation von neuen Inhibitoren.
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