Establishment of a model system for studying polyacetylene biosynthesis in Asteraceae and studies on transformation and cryopreservation of carrot cells
Plant specialized metabolism is a rich source of bioactive compounds for pharmaceutical use. Metabolic engineering represents one possibility for biotechnological production of specialized metabolites. The goal of the present work was to compare the suitability of three species of the Asteraceae for studies on plyacetylene biosynthesis and to conduct first steps for the biotechnological production of glucosinolates in a heterologous plant system. Polyacetylenes are a group of specialized metabolites with several C-C-triple bonds and derived compounds which are widely distributed in the plant kingdom especially in the Asteraceae family. Enzymes involved in polyacetylene biosynthesis are largely unknown. Tagetes patula, Arctium lappa and Carthamus tinctorius (Asteraceae) were cultivated on soil and tissue cultures were established. The polyacetylene profiles showed that C. tinctorius seedlings and flowers as well as T. patula roots and flower buds contain high polyacetylene levels (up to 30 µmol/g dry weight (d.w.)) and are likely major sites of polyacetylene biosynthesis while A. lappa contained less than 1 µmol/g d.w. Methyljasmonate (MeJ)-induced T. patula hairy root cultures proved to be an excellent source of butenynyl-bithiophene (200 µmol/g d.w.) while T. patula flower buds could serve as a source of pentenynyl-bithiophene and ?-terthienyl (5-10 µmol/g d.w.). C. tinctorius flowers and seedlings accumulate aliphatic C13 polyacetylenes. Upon addition of elicitors to tissue cultures, highest elicitation factors were reached for 1,11-tridecadiene-3,5,7,9-tetrayne in C. tinctorius callus suspension cultures with 40 µM MeJ and ?-terthienyl in T. patula hairy root cultures with 100 µM MeJ. Glucosinolates are sulfur- and nitrogen-containing thioglucosides found in the order Brassicales. The pathway for benzylglucosinolate biosynthesis is known. To enable transfer of benzylglucosinolate biosynthesis to transgenic carrot suspension cultures, transformation and cryopreservation methods were established. The last three genes of benzylglucosinolate biosynthesis were transferred to carrot cells by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A maximum transformation efficiency of about 35 % was obtained when the cells were co-cultivated with A. tumefaciens (OD600 of 0.3) for three days with 100 µM acetosyringone.
Der Sekundärstoffwechsel der Pflanzen ist eine reiche Quelle bioaktiver Verbindungen, die pharmazeutisch genutzt werden können. Das Metabolic Engineering bietet die Möglichkeit, pflanzliche Sekundärstoffe auf biotechnologischem Wege zu produzieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Eignung von drei Arten der Asteraceae für Untersuchungen zur Biosynthese der Polyine zu vergleichen und erste Vorausstzungen für die biotechnologische Produktion von Glucosinolaten in einem heterologen pflanzlichen System zu schaffen. Polyine sind eine Gruppe pflanzlicher Sekundärstoffe mit mehreren C-C-Dreifachbindungen und ihre Derivate, die im Pflanzenreich, insbesondere in der Familie der Asteraceae, weit verbreitet sind. Die Enzyme der Polyinbiosynthese sind weitgehend unbekannt. Tagetes patula, Arctium lappa and Carthamus tinctorius (Asteraceae) wurden auf Erde kultiviert und Gewebekulturen wurden etabliert. Die Analyse der Polyinprofile zeigte, dass Keimlinge und Blüten von C. tinctorius sowie Wurzeln und Blütenknospen von T. patula reich an Polyinen (bis zu 30 µmol/g Trockengewicht (d.w.)) und vermutlich Hauptorte der Biosynthese sind, während A. lappa weniger als 1 µmol/g d.w. enthielt. Methyljasmonat (MeJ) -induzierte Hairy-Root-Kulturen von T. patula erwiesen sich als ausgezeichnete Quelle für Buteninyl-Bithiophen (200 µmol/g d.w), während Blütenknospen von T. patula- reich an Penteninyl-Bithiophen und ?-Terthienyl (5-10 µmol/g d.w.) waren. Blüten oder Keimlinge von C. tinctorius enthielten aliphatische C13-Polyine. Nach Zugabe von Elicitoren zu Gewebekulturen wurden die höchsten Induktionsfaktoren in Kallussuspensionskulturen von C. tinctorius mit 40 µM MeJ für 1,11-Tridecadien-3,5,7,9-tetrain und in Hairy-Root-Kulturen von T. patula mit 100 µM MeJ für ?-Terthienyl erreicht. Glucosinolate sind schwefel- und stickstoffhaltige Thioglykoside, die in der Ordnung Brassicales vorkommen. Der Biosyntheseweg von Benzylglucosinolat ist bekannt. Um den Transfer der Benzylglucosinolat-Biosynthese in Kalluskulturen von Daucus carota (Apiaceae) zu ermöglichen, wurden Transformations- und Kryokonservierungsverfahren etabliert. Drei Gene der Benzylglucosinolat-Biosynthese wurden durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation in die Möhrenzellen übertragen. Eine maximale Transformationseffizienz von etwa 35% wurde erhalten, wenn die Zellen für drei Tage mit A. tumefaciens (OD600 von 0,3) mit 100 µM Acetosyringon co-kultiviert wurden.
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