Untersuchungen der Populationsheterogenität während der heterologen Proteinproduktion in Bacillus megaterium

Bei Bacillus megaterium handelt es sich um einen attraktiven Wirt für die heterologe Protein- produktion, dessen Expressionssystem mit Hilfe eines Xylose-induzierbaren Promotors (PxylA) immer mehr zu einer Produktionsmaschinerie für rekombinante Proteine entwickelt wurde. Das System basiert auf einem multicopy Plasmid, dessen Bestandteile aus dem genomischen xylABT-Operon stammen. In Abwesenheit von Xylose wird die Expression des Operons durch den Xylose-Repressor xylR verhindert. In Gegenwart von Xylose bindet diese an den Repressor, was die Repression aufhebt und die Expression des Operons bewirkt. Zur Validierung wurde das mittels Fluoreszenzmessung leicht nachweisbare eGFP, an den PxylA-Promotor fusioniert. Obwohl Vektorsysteme entwickelt wurden, die bis zu 1,25 g/l eGFP produzierten, zeigte ein Teil der Kultur auf Einzelzellebene eine Heterogenität bezüglich der Proteinproduktion. Daten aus qRT-PCR-Analysen von sortierten Zellen deckten die relativen Expressionsverhältnisse der beteiligten Gene auf. Daraufhin wurden drei mögliche Faktoren untersucht. Durch die Induktion des XylR-Repressors könnte zum einen freie Xylose wegtitriert werden, was die Gleichgewichte in der Zelle verschieben würde (1). Zum anderen könnten ungleichmäßige Plasmidverteilungen als Folge der Zellteilung (2) oder Effekte beim Altern von Zellen (3) eine maßgebliche Rollen spielen. Um dies zu überprüfen, wurde XylR mit dem Fluoreszenzprotein mCherry fusioniert und Zeitraffer-Filme einer wachsenden Mikrokolonie aufgenommen. Dabei wurde sowohl die Produktion von eGFP, als auch von mCherry als Reaktion auf Xylose aufgezeichnet. Des Weiteren wurde ein Plasmid konstruiert, dem das xylR-Gen fehlt. Um konkrete molekulare Informationen über den Einfluss der Plasmidkopienzahl zu gewinnen, wurde das Plasmid durch zusätzliche XylR-Bindestellen, die mit mCherry fusioniert wurden, visualisiert. Analysen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurden zur direkten zellulären Lokalisation des Plasmids eingesetzt. Die gewonnen Daten legten nahe, dass selbst bei selektiven Bedingungen die beobachtete bimodale Verteilung kein Resultat von Gen-Regelkreisen war, sondern ein Phänomen der ungleichen Plasmidsegregation zwischen Tochterzellen. Die Beobachtungen wurden in ein mathematisches Modell integriert, um das bistabile Produktionsverhalten über Computersimulationen zu reproduzieren.