Zelllinienentwicklung zur Verbesserung der Expression rekombinanter Glykoproteine für die Kristallisation

Karste, Katharina

doi:10.24355/dbbs.084-201711021213

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Zelllinienentwicklung zur Verbesserung der Expression rekombinanter Glykoproteine für die Kristallisation

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Glykoproteine sind für die pharmazeutische Industrie von großem Interesse, da sie wichtige „Drug Targets“ bei der Entwicklung neuer Medikamente darstellen. Um neue Wirkstoffe entwickeln zu können, sind detaillierte Informationen über die Struktur und Funktionsweise beteiligter Proteine bei der Entstehung von Krankheiten notwendig. Für genauere Untersuchungen müssen die Proteine in ausreichender Menge und Qualität zur Verfügung stehen. Hierbei ist v.a. die Wahl eines geeigneten Expressionssystems wichtig. Die Produktion korrekt glykosylierter Proteine erfordert die Verwendung eukaryotischer Systeme, da diese in der Lage sind posttranslationale Modifikationen und komplexe Faltungen vorzunehmen. Die dabei am häufigsten zum Einsatz kommenden Zelllinien sind die Human Embryonic Kidney (HEK293) und die Chinese Hamster Ovary (CHO) Zelllinie. Dabei kann die rekombinante Proteinexpression auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Einmal transient oder durch die Erzeugung einer stabilen Zelllinie, bei der das Transgen im Genom der Wirtszelle integriert vorliegt. Beide Systeme haben ihre Vor- und Nachteile bezogen auf den erforderlichen Zeit- und Arbeitsaufwand bis zum fertigen Produkt, der Reproduzierbarkeit des Herstellungsprozesses und der Ausbeute an exprimierten Protein. Um Aussagen über die komplexe Raumstruktur eines Proteins treffen zu können bedient man sich in der Regel der Röntgenstrukturanalyse. Hierfür muss das Protein in Form eines Kristalls vorliegen. Dies erfordert das Vorhandensein von hochreinem, löslichem und homogenem Protein, was sich insbesondere bei Glykoproteinen durch den heterogenen Charakter der komplexen Glykanseitenketten als schwierig erweisen kann. Ziel dieser Arbeit war es eine HEK293-6E Glykosylierungsmutante durch den CRISPR/Cas9 vermittelten Knockout des MGAT1-Gens zu generieren, welches für die Erzeugung komplexer N-Glykosylierungen verantwortlich ist. Die neu generierte Zelllinie ermöglicht die transiente Expression und Kristallisation des Oberflächenproteins Hämagglutinin H1 des Influenza A Virus. In einem zweiten Projekt sollte die Generierung stabiler Produzentenzellen für die rekombinante Proteinexpression für die Kristallisation optimiert werden. Hierfür wurde eine neue Generation CHO Lec3.2.8.1 RMCE-Masterzellen entwickelt, welche eine einfache und schnelle Herstellung jeder beliebigen Produzentenzelllinie mit Hilfe des Rekombinase-vermittelten Kassettenaustauschs ermöglicht.

Glycoproteins are of big interest especially for the pharmaceutical industry as they represent important drug targets. For the development of new active substances there is a need for detailed information about the structure and function of proteins which are involved in the formation of severe diseases. For precise structural analysis proteins have to be available in sufficient amounts and quality. The choice of the right expression system has a great influence. Due to their capability of post-translational modifications and complex folding, eukaryotic systems are applied. The most common cell lines are the human embryonic kidney (HEK293) and the chinese hamster ovary (CHO) cell line. Protein expression can be carried out in two different ways. First, transient protein expression systems can be applied or second, a stable cell line where the transgene is integrated into the genome can be generated to express the recombinant protein. Both systems have their advantages and disadvantages relating to the time-, scale- and labor effort until the product is ready to use, the reproducibility of the manufacturing process and the achievable yield of expressed proteins. For structural predictions of a certain protein X-Ray structure analysis is utilized. Proteins have to be available in form of a crystal. Therefore the generation of pure, soluble and homogenous protein is necessary which can be problematic due to the heterogeneous character of the complex glycan side chains. A major goal of this work was the establishment of a HEK293-6E glycosylation mutant cell line via CRISPR/Cas9 driven knockout of the MGAT1-gene, regulating the formation of complex N-glycosylation. This new cell line was successfully used for the transient production and crystallization of the surface protein hemagglutinin H1 from influenza A virus. In a second project the generation of stable producer lines for the recombinant protein expression for crysatallisation should be optimized. Therefore a new generation CHO Lec3.2.8.1 RMCE master cells was established. This novel cell line enables the simple and fast generation of any producer cell line by the recombinase mediated cassette exchange (RMCE).