Structural and functional characterization of adhesins and the virulence regulator RovC of Yersinia pseudotuberculosis

Sadana, Pooja

doi:10.24355/dbbs.084-201706221139

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Structural and functional characterization of adhesins and the virulence regulator RovC of Yersinia pseudotuberculosis

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German

Yersinia has several multifunctional adhesins on its surface that contribute to its pathogenicity. Their expression levels are regulated by several regulatory proteins in response to the rapidly changing environment. The projects presented here involve the structural and functional characterization of adhesins and the virulence regulator RovC of Yersinia pseudotuberculosis.YPIII strain of Y. pseudotuberculosis expresses four Invasins, which are InvA, InvB, InvC and InvD. So far, details on the regulation, structure and function of InvD have been elusive. In this project, the structure of InvD was determined by X-ray crystallography. By several in vitro and ex vivo experiments, the role of InvD in binding VH3/VK1 fragment of the antibody and B cells was established.In addition to InvD, a novel Invasin, InvE has been identified in the IP31758 strain of Y. pseudotuberculosis. In this work, the crystal structure of InvE was solved and the shape was confirmed in solution by small angle X-ray scattering (SAXS). The C-terminal domain of InvE adopts a C-type lectin like fold and shares high structural similarity with the C-type lectin like domain of InvA and Intimin, even though there exists no sequence homology among these proteins.YadA of Y. enterocolitica (ent) and Y. pseudotuberculosis (pstb) exhibit differences in their specificity of extracellular matrix (ECM) substrate binding, which results from a 31 amino acid insertion in YadApstb. The aim of this work was to provide the structural basis for the functional transition by solving the structure of YadApstb and to compare it with the known YadAent structure. For that purpose, the crystal structure of the head domain of YadApstb was solved. The results show that the insertion region is located at the tip, which is likely to change the tip surface and influence ECM specificity.A novel virulence regulator, RovC has been identified in Y. pseudotuberculosis that activates transcription of the Type6-secretion system. To gain insight into the DNA binding mechanism of RovC, its crystal structure was solved. SAXS analysis revealed a hexameric ring shaped structure of RovC, which was validated by Multi Angle Laser-light Scattering and site-directed mutagenesis studies. Furthermore, site-directed mutagenesis approach was used to characterize the DNA binding activity and the model has been proposed in which DNA wraps around the surface of hexameric RovC.

Yersinia weist zahlreiche multifunktionelle Adhesine auf der Zell-Oberfläche auf, die einen wichtigen Beitrag zur Pathogenizität leisten. Die Expression der Adhesine wird dabei durch verschiedene regulatorische Proteine gesteuert, um sich an die wechselnden Lebensräume und Wachstumsbedingungen anzupassen. Die hier präsentierten Projekte behandeln die strukturelle und funktionelle Charakterisierung verschiedener Adhesine und des Virulenz-Regulators RovC von Yersinia pseudotuberculosis. Der Stamm YPIII von Y. pseudotuberculosis exprimiert die vier Invasine InvA, InvB, InvC und InvD. Details zur Regulation, Struktur und Funktion von InvD sind bisher unbekannt. In diesem Projekt wurde daher die Struktur von InvD mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Weiterhin konnte eine spezifische Bindung von InvD an VH3/VK1 Antikörper und B-Zellen nachgewiesen werden. Im Stamm IP31758 wurde kürzlich ein weiteres Invasin, InvE, identifiziert, dessen Struktur in dieser Arbeit aufgeklärt wurde. Die Faltung der C-terminalen Domäne entspricht der von C-Typ Lektin-ähnlichen Domänen und trotz fehlender Sequenzhomologie weist diese Domäne von InvE sehr große strukturelle Ähnlichkeiten zu den C-Typ Lektin-ähnlichen Domänen von InvA und Intimin auf. YadA-Varianten von Y. enterocolitica (ent) und Y. pseudotuberculosis (pstb) weisen Unterschiede bezüglich ihrer Bindungsspezifität gegenüber Komponenten der Extrazellulären Matrix (EZM) auf, die auf einer Insertion von 31 Aminosäuren in YadApstb basieren. Ziel dieser Arbeit war, den Einfluss dieser Insertion über die Strukturaufklärung von YadApstb und den Vergleich mit der bekannten Struktur von YadAent zu analysieren. Dazu wurde die Struktur von YadApstb in dieser Arbeit aufgeklärt. Diese zeigt, dass die Insertion an der Spitze des YadApstb-Trimers liegt, die Oberfläche dieser Region verändert und darüber wahrscheinlich auch die Bindespezifität gegenüber EZM-Komponenten verändert wird. Ein neuer Virulenz-Regulator, RovC, wurde kürzlich in Y. pseudotuberculosis identifiziert, der die Transkription von Genen des Typ6-Sekretionssystems reguliert. Um einen Einblick in den Mechanismus der DNA-Bindung zu erhalten, wurde die RovC-Struktur in dieser Arbeit aufgeklärt. Über verschiedene Experimente wurde gezeigt, dass RovC einen hexameren Ring in Lösung ausbildet. Die DNA-Bindung wurde durch Mutagenese charakterisiert und basierend auf diesen Daten wurde ein Modell postuliert, in dem sich die DNA um das RovC-Hexamer windet.