Untersuchungen zur funktionellen Charakterisierung von spezifizierenden Proteinen des Glucosinolatstoffwechsels der Brassicaceae

Pflanzen der Brassicales nutzen das Glucosinolat-Myrosinase-System zur Verteidigung gegen Fraßfeinde und Pathogene. Bei Gewebeverletzung werden Glucosinolate durch Myrosinasen unter Bildung giftiger Isothiocyanate hydrolysiert. In Anwesenheit spezifizierender Proteine entstehen alternative Produkte. Nitril-spezifizierende Proteine (NSPs) führen zur Bildung von Nitrilen. Arabidopsis thaliana besitzt fünf NSP-Gene (AtNSP1-AtNSP5). Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von AtNSP1-AtNSP5 auf die Bildung der Glucosinolat-Abbauprodukte in Homogenaten der Samen und Keimlinge von A. thaliana Col-0 untersucht. Um die Funktion spezifizierender Proteine besser zu verstehen, sollte ihre subzelluläre Lokalisation geklärt werden. Außerdem sollte versucht werden, ihre Interaktion mit der Myrosinase TGG1 in planta nachzuweisen. In Homogenaten der Samen und Keimlinge von A. thaliana Col-0 wurden Glucosinolate vorherrschend zu Nitrilen abgebaut. Die Analyse der T-DNA-Mutanten nsp2-1 und nsp2-2 zeigte, dass AtNSP2 in Samen für die Nitrilbildung verantwortlich ist. Im Homogenat von Keimlingen der nsp1-1-Mutante war die Nitrilbildung gegenüber dem Wildtyp stark reduziert. Daher scheint AtNSP1 in Keimlingen verantwortlich für die Nitrilbildung zu sein. Zudem könnten AtNSP3, AtNSP4 und AtNSP5 zur Nitrilbildung in Keimlingen beitragen. Zur Analyse der subzellulären Lokalisation wurden AtNSP1, AtNSP2, AtNSP4, AtNSP5, At3g07720 und das Thiocyanat-formende Protein aus Thlaspi arvense in Fusion mit dem Fluoreszenzprotein Venus transient in Nicotiana benthamiana exprimiert. Alle untersuchten Proteine waren im Cytosol lokalisiert. Zur Untersuchung der Interaktion zwischen TGG1 und AtNSP3 in planta mittels bimolekularer Fluoreszenz-Komplementation wurden die in verschiedenen Kompartimenten von N. benthamiana-Zellen in Fusion mit Reporter-Fragmenten produzierten Proteine in einem Blattextrakt untersucht. Der Nachweis scheiterte bei Verwendung der Reporter-Fragmente VYNE und SCYCE an einer starken Hintergrundfluoreszenz. Mit mCherry als Reporter war die Hintergrundfluoreszenz geringer, aber kein Fluoreszenzmaximum im Interaktionsansatz nachweisbar. Bei cytosolischer Expression beider Interaktionspartner konnte nur die unglykosylierte Myrosinase (TGG1-oSP) betrachtet werden. Eine Interaktion zwischen TGG1-oSP und AtNSP3 ließ sich dann nachweisen. Entsprechende Untersuchungen mit TGG1-oSP und AtNSP5 bzw. At3g07720 führten nicht zum Nachweis einer Interaktion.