Fluorescence microscopy for interference lithography: Set-up design and pattern characterization by fluorescence modulation
In the course of this thesis, a novel approach for creating a regular and well-defined interference pattern in the focal plane of a microscope’s objective is presented. The structured illumination pattern was created by two-beam interference within a self-built epi-fluorescence microscope. Beam separation was accomplished by two Wollaston prisms installed in separate rotation mounts. It was shown that the orientation of the interference lines in the focal plane of the objective was directly related to the beams’ position at the back focal plane and that the distance between two interference fringes was linearly proportional to the inverse of the beams’ distance at the back aperture. The structured illumination pattern was used as an interference lithography set-up by bleaching it into a self-built fluorescent photoresist. Fluorescent dyes which were located within or close to the nodes of the interference pattern remained intact thus creating a negative imprint of the pattern within the photoresist, consisting of defined lines containingfluorescent dyes. The line widths of the nodes were assessed by single molecule localization of individual fluorescent dyes using an alternating variable search method (AVM) based algorithm. The fluorescence data for the AVM algorithm was recorded by using fluorescence modulation. AVM results on single molecule localizations provided evidence that the dyes’ positions were distributed on sub-diffractional dimensions for non-modulated as well as for modulated fluorescence data. The full width at half maximum (FWHM) values of each distribution (approx. 70 nm) were much smaller than the diffraction limit of light with respect to the dye’s emission wavelength. Furthermore, it was shown that the temporal domain of fluorescence modulation allowed the spatial distinction of selected molecule pairs which were located in close proximity to one another. The photo-selection of regular modulation was substantially narrowed by applying a second de-excitation beam whose polarization plane was oriented perpendicular with respect to the excitation light's polarization vector. The effect named excitation polarization angle narrowing (ExPAN) increased the photo-selectivity of excitation and improved the temporal separability of dye pairs or trios compared to regular modulation.
Diese Arbeit stellt einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung eines regelmäßigen und wohl-definierten Interferenzmusters in der Fokusebene eines Mikroskopobjektivs vor. Das strukturierte Beleuchtungsmuster wurde durch Interferenz zweier Strahlen innerhalb eines selbst gebauten Epi-Fluoreszenzmikroskops erzeugt. Die Strahltrennung erfolgte durch zwei Wollaston-Prismen, die jeweils in Drehhalterungen montiert waren. Es wurde gezeigt, dass die Orientierung der Interferenzlinien in der Fokalebene des Objektivs in direkter Beziehung zur Position der Strahlen in der hinteren Brennebene steht und dass der Abstand zwischen zwei Interferenzstreifen linear proportional zum Kehrwert des Abstands der beiden Strahlen an der Rückapertur des Objektivs war. Das strukturierte Beleuchtungsmuster wurde als Interferenz-Lithographie-Aufbau verwendet, indem es in einen selbstgebauten fluoreszierenden Fotolack gebleicht wurde. Fluoreszierende Farbstoffe, die innerhalb oder nahe der Knoten des Interferenzmusters angeordnet waren, blieben intakt, wodurch ein negativer Abdruck des Musters innerhalb des Fotolacks erzeugt wurde, bestehend aus definierten Linien besetzt mit Fluoreszenzfarbstoffen. Die Linienbreiten der Knoten wurden durch Einzelmoleküllokalisierung von Fluoreszenzfarbstoffen mit Hilfe eines Algorithmus (engl. alternating variable search method, AVM) ermittelt. Die Fluoreszenzdaten für den AVM-Algorithmus wurden mittels Fluoreszenzmodulation aufgezeichnet. AVM Ergebnisse auf Basis von Einzelmoleküllokalisation lieferten Hinweise, dass die Verteilung der Farbstoffpositionen enger ist als das Beugungslimit sowohl für nicht-modulierte als auch für modulierte Fluoreszenzdaten. Die Halbwertsbreiten jeder Verteilung (etwa 70 nm) unterschritten die Beugungsgrenze des Lichts in Bezug auf die Emissionswellenlänge des Farbstoffs. Desweiteren zeigte sich, dass die zeitliche Domäne der Fluoreszensmodulation die räumliche Unterscheidung ausgewählter Molekülpaare erlaubte, die sich in unmittelbarer Nähe zueinander befanden. Die Fotoselektion der regulären Modulation konnte durch Anlegen eines zweiten Abregungsstrahls, dessen Polarisationsebene senkrecht zum Polarisationsvektor des Anregungslichts orientiert ist, wesentlich verengt wird. Dieser Effekt namens excitation polarization angle narrowing (ExPAN), erhöhte die Selektivität der Anregung und verbesserte die zeitliche Trennbarkeit von Molekülpaaren und -trios in Vergleich zur regulären Modulation.
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