Characterization of the prokaryotic HemW and eukaryotic RSAD1 heme chaperones

Haskamp, Vera

doi:10.24355/dbbs.084-201702100943-0

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Characterization of the prokaryotic HemW and eukaryotic RSAD1 heme chaperones

English
German

Modified tetrapyrroles are complex macrocycles and the most abundant pigments found in nature. They play a central role in electron transfer dependent energy generating processes such as photosynthesis and respiration. They further function as prosthetic groups for a variety of enzymes, including catalases, peroxidases, cytochromes of the P450 class and sensor molecules. Heme is a hydrophobic molecule and associates non-specifically with lipids and proteins in aqueous solution where it promotes peroxidations. Due to its hydrophobicity und toxicity, heme has to be transported to its target proteins by different mechanisms, e.g. transport by transmembrane proteins, heme binding proteins and heme chaperones. In this context, the characterization of a novel heme chaperone called HemW in bacteria and RSAD1 in eukaryotes was the aim of this study. To characterize the heme binding of Escherichia coli HemW, the protein was overproduced, anaerobically purified and incubated with hemin afterwards. UV-vis spectroscopy and heme staining revealed clearly a heme binding. For studying the heme binding several conserved amino acid residues were exchanged and the HemW variants were analysed. Above all, the protein coordinates a [4Fe-4S]2+ cluster which was characterized with the help of EPR and Mössbauer spectroscopy. This [Fe-S] cluster was shown to be necessary for dimerization of HemW. The focus of this study was the verification of the function as heme chaperone. For this purpose, the heme-depleted, inactive nitrate oxidoreductase NarGHI from E. coli was chosen. Finally, HemW was able to restore the activity of the heme-depleted nitrate oxidoreductase followed by a spectroscopical assay. A second project was the functional study of RSAD1 in Danio rerio. Whole mount in-situ hybridization revealed the presence of RSAD1 in the high respiration organs heart, head and gills depending on the developmental stage of the fish. Furthermore, transfection of COS-7 cells with a rsad1 construct showed the location of RSAD1 in the mitochondria. Altogether, the heme chaperone HemW/RSAD1 was identified and characterized in this work.

Tetrapyrrole sind komplexe Makromoleküle und die am meisten vorkommenden Pigmente in der Natur. Sie spielen eine zentrale Rolle in elektronentransfer-abhängigen energie-generierenden Prozessen wie zum Beispiel die Photosynthese und der Atmungskette. Darüber hinaus bilden sie die prosthetische Gruppe vieler Enzyme, wie zum Beispiel der Katalasen, Peroxidasen, Cytochromen oder Sensormolekülen. Häm ist ein hydrophobes Molekül, welches in wässriger Umgebung mit Lipiden und Proteinen interagiert und zur Peroxidation führt. Aufgrund der Hydrophobizität und Toxizität muss Häm durch Häm-bindene Proteine oder Häm-Chaperone zu den Zielorten transportiert werden. In diesem Zusammenhang sollte in dieser Arbeit das Häm-Chaperon, genannt HemW in Bakterien und RSAD1 in Eukaryoten, untersucht werden. Um die Hämbindung von HemW aus Escherichia coli zu untersuchen, wurde das Protein überproduziert, anaerob gereinigt und anschließend mit Hemin inkubiert. UV-vis Spektroskopie und Hämfärbung weisten eindeutig eine Hämbindung nach. Um genauere Informationen über die Hämbindung zu erlangen, wurden konservierte Aminosäurereste ausgetauscht und die HemW Varianten untersucht. Darüber hinaus koordiniert HemW ein [4Fe-4S]2+ cluster, welches mit Hilfe der EPR- und Mössbauer- Spektroskopie analysiert wurde. Es zeigte sich außerdem, dass das [Fe-S] cluster für die Dimerisierung des Proteins verantwortlich ist. Der Fokus der Arbeit lag auf der Überprüfung der Funktion als Häm-Chaperon. Dafür wurde eine häm-freie, inaktive Variante der Nitrat-Oxidoreductase NarGHI von E. coli gewählt. Es konnte der Hämtransfer von HemW auf die NarGHI aufgrund der wiederhergestellten Aktivität mittels einer spektroskopischen Untersuchung bestätigt werden. Ein weiteres Projekt bestand in der funktionellen Analyse von RSAD1 in Danio rerio. “Whole-mount” in-situ Hybridisierungen zeigten, abhängig von der Entwicklungsstufe, das Vorkommen von RSAD1 im Herzen, Kopf und Kiemen, also Organen mit hoher respiratorischer Aktivität. Außerdem wurden Cos-7 Zellen mit einem rsad1-Konstrukt transfiziert und zeigten die Lokalisierung von RSAD1 in den Mitochondrien. Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit das Häm-Chaperon HemW/RSAD1 identifiziert und charakterisiert werden.