Konformationelle Änderungen der archaeellen RNA Polymerase während des Transkriptionszyklus

Schulz, Sarah

doi:10.24355/dbbs.084-201701240910-0

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Konformationelle Änderungen der archaeellen RNA Polymerase während des Transkriptionszyklus

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Der erste Schritt der Genexpression ist die Transkription, bei der DNA in RNA umgeschrieben wird und die durch das Enzym RNA Polymerase (RNAP)ausgeführt wird. Die Transkription ist ein sehr dynamischer Prozess und wird durch das Zusammenspiel von RNA Polymerase und den Transkriptionsfaktoren reguliert. RNA Polymerasen bestehen aus mehreren Untereinheiten, die sich in funktionelle Einheiten gliedern, aber auch multiple flexible Elemente aufweisen, die im Laufe des Transkriptionszyklus Konformationsänderungen durchlaufen. Besonders eine dieser Domänen - die RNA Polymerase Clamp - ist strukturell sehr flexibel. Röntgenkristallstrukturen sowie Strukturen, die aus Kryo-Elektronenmikroskopie-Untersuchungen hervorgegangen sind, zeigen die Clamp in unterschiedlichen Konformationszuständen. Zudem ist die RNAP Clamp Ziel regulatorischer Transkriptionsfaktoren, wie z.B. TFE und Spt4/5, die an die Clamp assoziieren. Dies hebt die besondere Bedeutung der RNAP Clamp für die Funktion der RNAP hervor. Jedoch blieben die molekularen Mechanismen der Transkriptionsfaktoren bisher schwer nachvollziehbar. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Messungen die Position der RNAP Clamp aus dem archaeellen Organismus Methanocaldococcus jannaschii in Abhängigkeit von unterschiedlichen Nukleinsäuren, Transkriptionsfaktoren, Zusammensetzung der RNA Polymerase und der Stufe im Transkriptionszyklus untersucht. Zunächst wurde die RNAP Clamp in einer freien Konfiguration mit unterschiedlicher Untereinheitenkomposition gemessen und anschließend der Einfluss des Transkriptionsfaktors TFE und des Elongationsfaktors Spt4/5 auf die Position der Clamp untersucht. Es wurde gezeigt, dass die RNAP Clamp beim Übergang vom geschlossenen zum offenen Prä-Initiationskomplex, das in DNA-Schmelzen resultiert, sich öffnet und das Öffnen durch TFE stimuliert wird. In Elongationskomplexen wird die RNAP Clamp durch den nicht-kodogenen Strang sowie durch Spt4/5 reguliert. TFE und Spt4/5 verschieben das Gleichgewicht in Richtung einer Hauptkonformation und beeinflussen die Struktur der RNAP möglicherweise durch einen allosterischen Schalter, womit eine mechanistische Erklärung für die Funktion der Faktoren geliefert wird. Insgesamt nimmt die RNAP Clamp vier unterschiedliche Konformationen ein, die von den Untereinheiten Rpo4/7, vom nicht-kodogenen Strang und den Transkriptionsfaktoren TFE und Spt4/5 abhängig sind.

Transcription is the first step in gene expression in which the DNA is transcribed into RNA and which is carried out by the enzyme RNA Polymerase (RNAP). Transcription is an intrinsically dynamic process which is regulated by the interplay of the RNAP and its transcription factors. RNAPs consist of multiple subunits that contain flexible domains. Further these domains undergo conformational changes throughout the transcription cycle. One of the RNAP domains - RNAP clamp - is a structurally mobile element. Both X-ray structures and cryo-electron microscopy reveal the clamp in multiple conformational states. Furthermore the RNAP clamp is a target for regulatory transcription factors e.g. for TFE and Spt4/5, which both associate to the clamp. This emphasizes that the clamp is an important functional regulator. But the molecular mechanisms of the transcription factors have remained elusive. In this work, single-molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) was used to monitor archaeal 12-subunit RNAP clamp conformations in the presence of different nucleic acids, transcription factors, compositions of the RNAP and to study these conformations at each step in transcription initiation and elongation. The RNAP clamp conformation was investigated in a free RNAP with different subunit-compositions and the influence of the transcription factor TFE and the elongation factor Spt4/5 on the clamp conformation was measured. The transition from the closed to the open pre-initiation complex, resulting in DNA-melting, leads to a clamp opening, which is stimulated by TFE. The RNAP clamp is modulated by the non-template strand and by Spt4/5 in elongation complexes. TFE or Spt4/5 shift the equilibria towards one of the main conformations suggesting that both prompt an allosteric switch that influences the structure of the RNAP and thereby provide a mechanistic rationale for the function of these factors. Taken altogether, the RNAP clamp adopts four different conformational states which are dependent on the subunits Rpo4/7, the non-template strand and the transcription factors TFE and Spt4/5.