Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Sirohäm-Decarboxylasen NirDLGH aus Pseudomonas aeruginosa und NirDL aus Hydrogenobacter thermophilus

Haufschildt, Kristin

doi:10.24355/dbbs.084-201608101042-0

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Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Sirohäm-Decarboxylasen NirDLGH aus Pseudomonas aeruginosa und NirDL aus Hydrogenobacter thermophilus

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Unter anaeroben Bedingungen gewinnen Pseudomonas aeruginosa und Hydrogenobacter thermophilus Energie durch die Reduktion von Nitrat zu Stickstoff während der Denitrifikation. Im zweiten Schritt der Denitrifikation reduziert die Cytochrom-cd1-Nitritreduktase (NirS) Nitrit zu Stickstoffmonoxid. Die NirS enthält zwei Kofaktoren Häm c und Häm d1. Die Enzyme, die an der Häm d1-Biosynthese beteiligt sind, sind durch das Genecluster nirSMCFDLGHJEN kodiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Sirohäm-Decarboxylasen NirDLGH (P.a.) und NirDL (H.th.) charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine NirL und NirH als Repressor bzw. Aktivator für die nirJEN-Gene fungieren, wobei die alleinige Überproduktion von NirL oder NirH keinen Einfluss auf die Promotoraktivität hat. Die enzymatische Aktivität von NirDLGH (P.a.) konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Dabei wird das Substrat Sirohäm (SH) über das Intermediat Monodecarboxy-Sirohäm (MDSH) zu 12,18-Didecarboxy-Sirohäm (DDSH) umgesetzt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass NirDL in vitro SH als Substrat nutzt und MDSH entsteht. NirGH kann SH nicht als Substrat verwerten sondern nutzt MDSH und setzt es zu DDSH um. Zusätzlich wurde die Struktur des NirDLGH-Homologons NirDL (H.th.) ohne und mit dem künstlichen Substrat Eisen-Uroporphyrin III (FeUroIII) geklärt. Dabei zeigte sich, dass das Protein ein Helix-Turn-Helix-Motiv beinhaltet, das für Transkriptionsregulatoren typisch ist. Zusätzlich dazu enthält NirDL eine Substratbindedomäne, die durch die Bindung des Substratanalogons deutlich sichtbar war. Ähnlich wie NirDLGH (P.a.) ist NirDL (H.th.) ebenfalls in der Lage SH zu DDSH umzusetzen. Durch den gezielten Austausch einzelner Aminosäuren und der Untersuchung der NirDL-Varianten konnte diesen Aminosäuren spezifische Aufgaben in der Enzymaktivität und Substratbindung zugeordnet werden. Die Aminosäure Histidin-261 ist für die Bindung und Koordinierung des Substrats im aktiven Zentrum zuständig, wohingegen das Histidin-93 direkt an der Decarboxylierung des Substrats beteiligt ist. Ausgehend von den Ergebnissen der NirDL-Varianten wurde ein potentieller Reaktionsmechanismus nach dem Vorbild der Uroporphyrinogen III-Decarboxylase postuliert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass NirDLGH (P.a.) und NirDL (H.th.) an der Häm d1 Biosynthese beteiligt sind. Während NirDL (H.th.) Strukturelemente eines Transkriptionsregulators aufweist, konnte die regulatorische Aktivität für NirDLGH (P.a.) nachgewiesen werden.

Pseudomonas aeruginosa and Hydrogenobacter thermophilus generates energy under anaerobic growth conditions through the stepwise reduction of nitrate to molecular nitrogen during denitrification. In the second step of denitrification nitrite is converted into nitric oxide by the cytochrome cd1 nitrite reductase (NirS). NirS contains two essential cofactors, heme c and heme d1. The enzymes which are involved in the synthesis of the isobacteriochlorin heme d1 are encoded by the nirSMCFDLGHJEN gene cluster. During this work the siroheme decarboxylases NirDLGH (P.a.) and NirDL (H.th.) were functionally and structurally characterized. This work showed that the proteins NirL and NirH seem to act as a repressor and activator for the nirJEN-genes, nevertheless an overproduction of these proteins had no influence on the regulator activity. Additionally, the enzymatic activity of NirDLGH (P.a.) was shown. The substrate siroheme (SH) is converted to 12, 18-didecarboxy-siroheme (DDSH) via the intermediate monodecarboxy-siroheme (MDSH). The product DDSH is formed only in the presence of all four proteins NirDLGH. The heterodimeric complex NirDL uses SH as a substrate and catalyzes the conversion of SH to MDSH. NirGH is not able to utilize SH as a substrate. However, MDSH can be used as substrate and is converted into DDSH. The crystal structure of the homologous NirDL protein (H.th.) was solved as an apo protein and in complex with the substrate analogue iron-uroporphyrin III (FeUroIII). The protein illustrated a helix-turn-helix-motif, which is characteristic for a transcription regulator. Based on the co-complex structure of NirDL and the substrate analogue the putative active site was identified. Similarly to the activity of NirDLGH (P.a.), NirDL (H.th.) was able to convert SH into DDSH. By employing specific amino acid exchange, specific functions for different amino acids were assigned. For instance, the amino acid histidine-261 is involved in the coordination and binding of the substrate and the histidine-93 is directly responsible for the decarboxylation of the acetate site chains. A putative reaction mechanism based on the results of the NirDL variants was proposed. All in all it has been shown that NirDLGH (P.a.) and NirDL (H.th.) are involved in the heme d1 biosynthesis and NirDLGH (P.a.) acts as a transcriptional regulator.