Modularisierung von Glykosyltransferasen und Untersuchungen zum Aktivitätsnachweis im Hochdurchsatzverfahren

Glykosyltransferasen (GT) katalysieren die Kondensation zwischen einem Zucker und einem weiteren Zuckermolekül oder einem Aglykon. Die Enzyme der Superfamilie GT-A und GT-B besitzen zwei Domänen, die durch eine Linker-Region (LR) miteinander verbunden sind. Die eine Domäne bindet den Zuckerdonor, die zweite Domäne bindet den Zuckerakzeptor. Aus dieser Struktur ergibt sich die Möglichkeit die Domänen verschiedener GT miteinander zu kombinieren, um Enzyme mit neuer Reaktivität zu erzeugen. Ziel der Arbeit war die Kombination der Zuckerakzeptor-Domäne der Hydrochinon-Glucosyltransferase (AS) mit geringer Substratspezifität und der Zuckerdonor-Domäne der Kämpferol-3-O-Galactosyltransferase (GalT) mit hoher Substratspezifität. Hierzu sollte eine Gen-Bibliothek chimärer GT erstellt werden. Der Aktivitätsnachweis sollte im Hochdurchsatz (HTS) etabliert werden. Für die Herstellung einer Gen-Bibliothek für chimäre GT mit definierten FP in der LR wurde die One-pot fusion-PCR entwickelt. Die Methode ITCHY wurde verwendet, um eine Bibliothek chimärer Gene mit zufälligen FP in der LR zu generieren. Alle Konstrukte wurden in E. coli exprimiert. Der Aktivitätsnachweis der heterolog exprimierten Ausgangsenzyme wurde geführt, indem die gebildeten Glykoside mittels HPLC-DAD nachgewiesen wurden. Die Reaktionsbedingungen wurden vereinheitlicht und es wurde gezeigt, dass beide Enzyme unter identischen Bedingungen analysiert werden können. Für den Nachweis im HTS wurde die mit der Glykosylierung verbundene Protonenfreisetzung mit einem pH-Indikator verfolgt. Keines der untersuchten Verfahren erwies sich für das HTS als verlässlich genug. Daher wurde für die AS eine HPLC-ESI-MS/MS-Methode zum Nachweis von p-Arbutin erarbeitet, welche auf Extrakte von E. coli mit chimären Konstrukten übertragen wurde. Die Identifizierung einer aktiven chimären GT gelang nicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die ICHTY-Technik eine zeitsparende Methode zur Erzeugung einer Gen-Bibliothek für chimäre GT darstellt. Um aktive Chimäre zu erzeugen, muss die Methode so optimiert werden, dass mehr chimäre Konstrukte entstehen, deren LR eine ähnliche Größe besitzt wie die LR der Ausgangsgene. Der pH-basierte Aktivitätsnachweis ist prinzipiell im HTS möglich, führt aber oft zu falsch-positiven Ergebnissen. Der spezifische Produktnachweis mittels HPLC-DAD und HPLC-ESI-MS/MS erscheint auf der Basis der vorliegenden Untersuchungen die Methode der Wahl für die Aktivitätsbestimmung im HTS zu sein.