Cytochrome P450 enzymes involved in xanthone biosynthesis in Hypericum species
Xanthones are a group of natural products found in fungi, lichens and some higher plant families. They possess a wide array of pharmacological activities and have recently gained attention as anti-Alzheimer’s agents. A key branching step in plant xanthone biosynthesis is represented by the regioselective cyclizations of 2,3',4,6-tetrahydroxybenzophenone into either 1,3,7- or 1,3,5-trihydroxyxanthones. Biochemical studies had previously revealed that these reactions are catalyzed by two distinct cytochrome P450 enzymes (CYPs) named trihydroxyxanthone synthases. No cDNAs encoding these enzymes have yet been isolated. Using a subtracted cDNA library from yeast extract-treated vs. non-treated Hypericum calycinum cell cultures and the publically available transcriptome database of Hypericum perforatum, cDNAs encoding three enzymes of the new CYP81AA subfamily have been cloned and heterologously expressed in yeast. Microsomes of recombinant yeast cells expressing the Hc and HpCYP81AA1 orthologs were surprisingly able to catalyze two consecutive reactions in the xanthone biosynthetic pathway; namely, the 3'-hydroxylation of 2,4,6-trihydroxybenzophenone into 2,3',4,6-tetrahydroxybenzophenone and the subsequent cyclization of the product para to the introduced hydroxyl group yielding exclusively 1,3,7-trihydroxyxanthone. In contrast, microsomes containing the HpCYP81AA2 paralog catalyzed the same set of reactions except that 1,3,5-trihydroxyxanthone was the main final product as a result of directing the cyclization ortho to the introduced hydroxyl group. The 3'-hydroxylation step had previously been believed to be catalyzed by an independent CYP. Sequence comparisons, analysis of the substrate recognition sites and homology modeling identified dissimilar contact residues which are most likely responsible for the alternative regioselectivities of these enzymes. Reciprocal site-directed mutagenesis revealed the involvement of Ser375, Leu378 and Ala483 in controlling the regioselectivity of HpCYP81AA2 which was converted into HpCYP81AA1 by a sextuple mutation. However, the corresponding residues in HpCYP81AA1 had only minor effects on its regiospecificity. The present work will enable a better understanding of the machinery of these bifunctional CYPs catalyzing hydroxylation/intramolecular C–O oxidative phenol couplings in xanthone biosynthesis in a regioselective manner.
Xanthone sind eine Gruppe von Naturstoffen, die in Pilzen, Flechten und einigen Familien höherer Pflanzen vorkommen. Sie besitzen ein breites Spektrum von pharmakologischen Aktivitäten und haben kürzlich wegen ihrer Wirkung gegen Alzheimer Aufmerksamkeit erregt. Ein zentraler Verzweigungsschritt in der pflanzlichen Xanthon-Biosynthese wird durch die regioselektiven Zyklisierungen von 2,3',4,6-Tetrahydroxybenzophenon zu entweder 1,3,7- oder 1,3,5-Trihydroxyxanthon repräsentiert. Biochemische Untersuchungen hatten früher gezeigt, dass diese Reaktionen von zwei distinkten Cytochrom P450-Enzymen (CYPs) katalysiert werden, die Trihydroxyxanthon-Synthasen heißen. Bisher waren noch keine cDNAs für diese Enzyme isoliert worden. Unter Verwendung einer subtraktiven cDNA-Bank aus Hefeextrakt-behandelten vs. unbehandelten Hypericum calycinum-Zellkulturen und der öffentlich verfügbaren Transkriptom-Datenbank von Hypericum perforatum wurden cDNAs für drei Enzyme der neuen CYP81AA-Subfamilie kloniert und heterolog in Hefezellen exprimiert. Mikrosomen der rekombinanten Hefezellen, in denen die Hc und HpCYP81AA1-Orthologe exprimiert wurden, katalysierten zwei aufeinander folgende Reaktionen im Xanthon-Biosyntheseweg, nämlich die 3'-Hydroxylierung von 2,4,6-Trihydroxybenzophenon zu 2,3',4,6-Tetrahydroxybenzophenon und die anschließende Zyklisierung des Produkts para zur eingeführten Hydroxylgruppe, was ausschließlich 1,3,7-Trihydroxyxanthon ergab. Die Mikrosomen aus Hefezellen, die das HpCYP81AA2-Paralog exprimierten, katalysierten denselben Satz von Reaktonen, jedoch war 1,3,5-Trihydroxyxanthon das finale Hauptprodukt als Ergebnis einer Zyklisierung ortho zur eingeführten Hydroxylgruppe. Sequenz-Vergleiche, die Analyse der Substraterkennungsregionen und Homologie-Modellierung identifizierten abweichende Kontaktreste, die wahrscheinlich für die alternativen Regioselektivitäten der Enzyme verantwortlich sind. Die reziproke ortsgerichtete Mutagenese enthüllte die Beteiligung von Ser375, Leu378 and Ala483 in der Kontrolle der Regioselektivität von HpCYP81AA2, welches in HpCYP81AA1 durch sechsfach-Mutation umgewandelt wurde. Jedoch hatten die entsprechenden Reste in HpCYP81AA1 nur geringe Auswirkungen auf seine Regiospezifität. Die vorliegende Arbeit wird für ein besseres Verständnis der Maschinerie der bifunktionalen CYPs sorgen, die auf regioselektive Weise Hydroxylierung und intramolekulare oxidative C–O Phenolkupplungen in der Xanthon-Biosynthese katalysieren.
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