Die Serin/Threonin Kinase Prp4 aus Schizosaccharomyces pombe verbessert die Erkennung von Introns mit schwachen Spleißstellen

Die Genexpression in eukaryotischen Zellen gliedert sich in Transkription und verschiedene Prozessierungsschritte, wozu auch das prä-mRNA Spleißen gehört. Dabei werden aus der prä-mRNA die Introns herausgespleißt und die Exons miteinander verknüpft, so dass die reife mRNA entsteht. Das Herausspleißen der Introns wird vom Spleißosom durchgeführt, welches anhand der Exon1/5´-Spleißstelle, der Verzweigungssequenz und der 3´-Spleißstelle den Anfang und das Ende des Introns erkennt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Serin/Threonin Kinase Prp4 untersucht, die am Spleißprozess beteiligt ist. Dazu wurde eine analog-sensitive Kinase konstruiert, die sich durch Zugabe des ATP-analogen Inhibitors 1NM-PP1 hemmen lässt. Sowohl die Analyse einzelner Introns durch RT-PCR als auch eine Sequenzierung der Gesamt-RNA zeigen nach Inhibition der Prp4 Kinase, dass zwei Klassen von Introns existieren. Die eine Klasse der Introns wird nach Inhibition der Kinase weiter effizient gespleißt, während die andere Klasse nach Inhibition prä-mRNA akkumuliert. Die Introns, die die Aktivität der Prp4 Kinase benötigen um gespleißt zu werden, werden als Prp4-abhängige Introns bezeichnet. Und die Introns, die nach Inhibition weiter effizient gespleißt werden, werden Prp4-unabhängig genannt. Der Vergleich beider Intronklassen zeigt ausschließlich in den Sequenzen der Spleißstellen geringfügige Unterschiede. Um zu untersuchen, ob die Sequenz der Spleißstellen bezüglich der Prp4-Abhängigkeit eine Rolle spielt, wurden zwei Reportergene konstruiert. Dazu wurden die Gene res1, dessen Intron Prp4 abhängig gespleißt wird, und ppk8, welches unabhängig von der Kinase gespleißt wird, ausgewählt und in den leu1-Lokus von Schizosaccharomyces pombe integriert. Die Mutationsanalyse von Exon1/5´-SS und Verzweigungssequenz zeigt, dass durch Erhöhung der Komplementarität zur U1 und U2 snRNA des Spleißosoms ein Prp4-abhängiges Intron in ein Prp4-unabhängiges Intron umgewandelt werden kann. Wird die Komplementarität der snRNAs zur prä-mRNA verringert, kann aus einem Prp4-unabhängig gespleißten Intron ein Prp4 abhängiges werden. Das zeigt, dass die Aktivität der Prp4 Kinase notwendig ist, um Introns zu spleißen, deren Spleißstellen von der Konsensussequenz abweichen und damit als schwach bezeichnet werden.