Untersuchungen zur rekombinanten Proteinproduktion und Tetrapyrrolbiosynthese in Bacillus megaterium

Finger, Constanze

doi:10.24355/dbbs.084-201510211016-0

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Untersuchungen zur rekombinanten Proteinproduktion und Tetrapyrrolbiosynthese in Bacillus megaterium

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In den letzten Jahren wurde Bacillus megaterium als Wirt für die Produktion rekombinanter Proteine stetig verbessert. Trotzdem bestehen Limitierungen. So verringert eine schlechte Codonanpassung eines rekombinanten Gens die Menge an rekombinatem Protein. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Einfluss coexprimierter tRNA-Gene auf die rekombinante Proteinproduktion in B. megaterium untersucht. Mit einem artifiziellen Codontestsystem mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Reporter konnte gezeigt werden, dass durch Coexpression von seltenen tRNA-Genen der negative Einfluss von Clustern gleicher seltener oder favorisierter Codons im 5‘-Bereich des gfp-Gens eliminiert und die rekombinante Produktion sogar bis zu 4,2-fach verbessert werden konnte. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Coexpression von einzelnen und mehreren seltenen tRNA-Genen die Produktion von rekombinanten intra- und extrazellulären Proteinen, deren Gensequenz nativ und codonoptimiert vorlag, beeinflusst. Neben der Inhibierung des Wachstums durch starke metabolische Belastung, verringerter oder unveränderter Produktion konnte die rekombinante Produktion bis zu 18-fach, unabhängig von der Sequenz des Gens, gesteigert werden. So konnte in dieser Arbeit erstmals durch Coexpression von tRNA-Genen, die seltene Codons bedienen, neben der Produktion rekombinanter Proteine auch die generelle Translationseffizienz in B. megaterium erhöht werden und somit die Grundlage für einen B. megaterium Stamm mit verbesserter Produktionskapazität geschaffen werden. Seit langem wird spekuliert, dass zwei aufeinanderfolgende Proteine der Tetrapyrollbiosynthese, die Porphobilinogendesaminase (HemC) und die Uroporphyrinogen-III-Synthase (HemD) einen Komplex bilden, um das labile Produkt von HemC, Preuroporphyrinogen, direkt an das Folgeenzym, HemD, weiterzugeben. In dieser Arbeit konnten über in vivo Analysen (Bacterial Two-Hybrid Assay; Förster-Resonanzenergietransfer) mit den Enzymen HemC und HemD aus B. megaterium Hinweise auf eine Interaktion erlangt werden. Für in vitro Analysen wurden die Proteine erfolgreich in großen Mengen in E. coli hergestellt und aufgereinigt. Cokristallationsansätze und Co-Immunopräzipitationsversuche konnten die Hinweise aus den in vivo Analysen zunächst nicht bestätigen, was jedoch mit Pulldownexperimenten möglich war. Somit bestätigt diese Arbeit eindeutig die Spekulation der Komplexbildung zwischen HemC und HemD.

In the last few years Bacillus megaterium was stepwise established as a host for the production of recombinant proteins. However, some limitations are still obvious. When observing the translation process a poorly adapted codon composition of a recombinant gene results in no or low recombinant protein yield. Consequently, in the first part of this work the influence of tRNA-genes on recombinant protein production in B. megaterium was analysed. Using an artificial codon test system with the green fluorescent protein (GFP) as reporter coexpression of rare tRNA-genes was shown to eliminate the negative influence of a cluster consisting of four rare or favoured codons introduced to the 5’-terminus of gfp and even led up to a 4.2 times increased recombinant protein production. Further, it could be shown that the coexpression of one or several rare tRNA-genes influences the production of recombinant intra-and extracellular proteins encoded by their native or codon-optimized gene sequence. Besides inhibition of growth due to a strong metabolic burden, the recombinant protein production was reduced, unchanged or could be increased up to 18 times, independent of the gene’s sequence. So for the first time the coexpression of tRNA-genes, whose gene products serve rare codons, was shown to result in both an increased production of recombinant proteins and in an increased general translational efficiency in B. megaterium. Thus, the basis for a B. megaterium strain with an enhanced protein production capacity was laid. For a long time there are speculations that the proteins porphobilinogen desaminase (HemC) and uroporphyrinogen-III-synthase (HemD) involved in tetrapyrrole biosynthesis form a protein complex to directly channel the instable product of HemC, preuroporphyrinogen, to the following enzyme HemD. In this work, clear indications for the interaction of the B. megaterium HemC and HemD could be obtained by in vitro analysis (bacterial two-hybrid in E. coli and Förster resonance energy transfer in B. megaterium). For subsequent in vitro analysis the proteins could be successfully produced and purified to a great extent. Although the co-crystallization and co-immunoprecipitation experiments failed to confirm the evidence obtained from the in vivo analysis, the pulldown experiments could also show the interaction. Hence, in this work the speculation of the complex formation between HemC and HemD has been verified.