Cinnamic Acid-Specific Type III Polyketide Synthases of Cajanus cajan (L.) Millsp

Zhang, Su

doi:10.24355/dbbs.084-201509151117-0

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Cinnamic Acid-Specific Type III Polyketide Synthases of Cajanus cajan (L.) Millsp

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C. cajan contains a large number of secondary metabolites with excellent biological activities, such as stilbenecarboxylate, flavonoids, stilbenes and isocoumarins. The aim of the work was to study the biosynthesis of stilbenecarboxylate at both the enzyme and the gene level. The biosynthesis of cajaninstilbene acid has been proposed to use a polyketide pathway. cDNAs encoding seven PKSs were successfully cloned, heterologously expressed, and functionally characterized. The candidates which were two PASs and five C.CHSs. For PAS enzymes, PAS1 produced CITAL and styrylpyrone in the enzyme assay with cinnamoyl-CoA and malonyl-CoA as the substrates. The cDNA has an ORF of 1182 bp, which encodes 394 amino acids. It shares 67.7 % identity with CHS on the amino acid level. PAS3 produced only styrylpyrone in the enzyme assay with cinnamoyl-CoA and malonyl-CoA as the substrates. The cDNA has an ORF of 1188 bp, which encodes 396 amino acids. It shares 65.4 % identity with CHS on the amino acid level. For C.CHSs, detection of pinocembrin together with CTAL and styrylpyrone as products in the enzyme assays with cinnamoyl-CoA and malonyl-CoA as substrates proved that C.CHS1-5 are indeed CHS clones. The cDNAs have ORFs of 1167, 1158, 1167, 1170 and 1176 bp in length for C.CHS1, C.CHS2, C.CHS3, C.CHS4 and C.CHS5, respectively. They share 77-91 % identity with CHS in the database on the amino acid level. Based on the catalytic efficiency (Kcat/Km), C.CHS1, C.CHS2 and C.CHS4 preferred cinnamoyl-CoA as starter substrate and C.CHS3 and C.CHS5 exhibited highest activity with p-coumaroyl-CoA. The polyketide cyclases that have been mentioned in recent studies were used as probes to search the C. cajan genome sequence for possible polyketide cyclases participating in stilbenecarboxylate formation. cDNAs encoding 11 candidates possibly involved were successfully cloned and heterologously expressed. The candidates can be subdivided in three groups based on three probe cyclases (CHI-like, DABB, and Betv1-like), which were five DACs, five BECs and one CHC. Co-incubation of PASs with the recombinant cyclases, however, resulted in no additional products or increases in original product amounts. All the enzyme assays performed failed to detect activity for stilbenecarboxylate biosynthesis.

C. cajan enthält eine große Anzahl von Sekundärmetaboliten mit ausgezeichneter biologischer Aktivitäten, wie stilbenecarboxylate, Flavonoide, Stilbene und Isocumarine. Das Ziel der Arbeit war es, die Biosynthese von stilbenecarboxylate sowohl auf dem Enzym und dem Gen-Ebene zu studieren. Die Biosynthese von cajaninstilbene Säure wurde vorgeschlagen, eine Polyketidweg verwenden. cDNAs sieben PKS codieren, wurden erfolgreich geklont, heterolog exprimiert und funktionell charakterisiert. Die Kandidaten, die mit zwei Durchgängen waren und fünf C.CHSs können in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der phylogenetischen Analyse einschließlich der Sonde CHS und der bekannten STCS aus Hydrangea macrophylla. Für PAS Enzyme produziert PAS1 CITAL und styrylpyrone im Enzymtest mit Cinnamoyl-CoA und Malonyl-CoA als Substrate. Die cDNA weist einen ORF von 1182 bp, der 394 Aminosäuren kodiert. Es teilt sich 67,7% Identität mit CHS auf Aminosäureebene. PAS3 nur erzeugt styrylpyrone im Enzym-Assay mit cinnamoyl-CoA und Malonyl-CoA als Substrat. Die cDNA hat einen ORF von 1188 bp, das 396 Aminosäuren kodiert. Es teilt 65,4% Identität mit CHS auf der Aminosäureebene. Für C.CHSs, Erkennung von Pinocembrin zusammen mit CTAL und styrylpyrone als Produkte in den Enzymtests mit Cinnamoyl-CoA und Malonyl-CoA als Substrat nachgewiesen, dass C.CHS1-5 sind in der Tat CHS-Klone. Die cDNAs haben ORFs von 1167, 1158, 1167, 1170 und 1176 bp lang für C.CHS1, C.CHS2, C.CHS3, C.CHS4 und C.CHS5 sind. Sie teilen sich 77 bis 91% ige Identität mit CHS in der Datenbank auf der Ebene der Aminosäuren. Bezogen auf die katalytische Effizienz (Kcat/Km), C.CHS1, C.CHS2 und C.CHS4 bevorzugt cinnamoyl-CoA als Startersubstrat und C.CHS3 und C.CHS5 zeigte die höchste Aktivität mit p-Cumaroyl-CoA. Polyketid Cyclasen, die in neueren Studien erwähnt wurden als Sonden verwendet, um die C. cajan Genomsequenz für mögliche Polyketid Cyclasen teilnehmenden stilbenecarboxylate Bildung zu suchen. cDNAs 11 Kandidaten möglicherweise beteiligt kodieren, wurden erfolgreich kloniert und heterolog exprimierten.