Natürliche Kompetenz und Proteinexport in Bacillus megaterium – Grundlagen und biotechnologische Anwendungen

Das Bakterium Bacillus megaterium wurde während der letzten 15 Jahre für die Produktion und Export rekombinanter Proteine im g/L Maßstab entwickelt. Dabei sind das Einbringen von DNA und der Proteinexport mittels SEC-Exportsystems limitierend. B. megaterium besitzt die Gene für ein natürliches Kompetenz-, also DNA-Aufnahmesystem, zeigt aber keine natürliche Kompetenz. So wurden zuerst 9 B. megaterium Wildtyp-Stämme auf natürliche Kompetenz untersucht, allerdings ohne Erfolg. Offensichtlich erfolgt die Regulation der Kompetenzgene deutlich anders als im gut transformierbaren Modellorganismus Bacillus subtilis. Um die Promotoraktivitäten der Kompetenzgene von B. megaterium zu analysieren, wurde zuerst das bakterielle Luziferase System als Reportersystem als sensitive Alternative zu Gfp etabliert. Damit konnte gezeigt werden, dass die Expression der Kompetenz-assoziierten Gene comGABCDEFG, comFA, comK und ssbB Wachstumsphasen- und Substrat-abhängig ist und durch die extrazelluläre Protease NprM negativ beeinflusst wird. Anschließende Transkriptomanalysen zeigten, dass NprM die Expression von 76 Genen reguliert. So wurde das Gen des globalen Übergangszustands-Regulator AbrB in einer nprM-Deletionsmutante ~13-fach geringer transkribiert. Diese Mutante war über etablierte Methoden besser transformierbar als der Wildtyp. Durch in silico Analysen konnte ComKBmeg, das eine Homologie zu dem zentralen Regulator der natürlichen Kompetenz in B. subtilis aufweist, der Gruppe der ComK2 Proteine zugeordnet werden, deren Funktion sich von ComKBsub unterscheidet. In dieser Arbeit gelang die rekombinante Produktion und Reinigung von ComKBmeg, was in Zukunft eine proteinbiochemische Untersuchung und Aufklärung der Funktion erlaubt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden im Genom von B. megaterium 308 Signalpeptide des SEC-Pathways bioinformatisch identifiziert. Um Funktionalität und Effektivität für die Sekretion rekombinanter Protein zu untersuchen, wurde ein Plasmid-basiertes Screening-System entwickelt, das den Einbau eines Signalpeptids und des Gens eines zu sekretierenden Proteins erlaubt. Der „proof of principle“ mit 41 Signalpeptiden und der a-Amylase AmyE als Reporterprotein zeigte, dass alle vorhergesagten Aminosäuresequenzen auch Signalpeptide waren und sich in ihrer Effizienz der Vermittlung des Proteinexports bis zu einem Faktor von 23 unterschieden. Es konnte kein Zusammenhang zwischen Aminosäuresequenz des Signalpeptids und Sekretionseffizienz abgeleitet werden.