Mobility shift-affinity capillary electrophoresis for investigation of protein-metal ion interactions: aspects of method development, validation and high throughput screening
Approximately one third of all proteins are metalloproteins, which means the metal ions are important for their biological functions. Therefore, investigation and characterization of interactions between proteins and metal ions are interesting. Several techniques can be used for these purposes. Mobility shift-affinity capillary electrophoresis has been selected over the other techniques due to its rapid analysis, small injection volume (nano-level), high separation efficiency, direct injection of impure samples and the ability to perform under physiological-like conditions. In order to facilitate the implementation of a mobility shift-affinity capillary electrophoresis method into routine binding studies, method acceleration, transfer and precision improvement were investigated. The mobility shift-affinity capillary electrophoresis method was successfully accelerated by using shorter capillaries, lower sample concentrations and smaller injection volumes. Fast run time of 4 min has been achieved. The precision of results was enhanced by slightly pushing the sample into the capillary, refreshing the buffer vials after each 30 runs and employing extra flushing after each 60 subsequent runs and using 0.1 M EDTA within the rinsing protocols. The accelerated mobility shift-affinity capillary electrophoresis method has been successfully applied for the interaction study of Li+, Na+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Al3+, Ga3+, La3+, Pd2+, Ir3+, Ru3+, Rh3+, Pt2+, Pt4+, Os3+, Au3+, Au+, Ag+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cr3+, V3+, MoO42- and SeO32- with bovine serum albumin, β-lactoglobulin, human serum albumin, myoglobin and ovalbumin. Excellent precision for mobility ratios was achieved for all protein-metal ion interactions (RSD% of 0.05-1.0%, n > 324). The calculated normalized difference of mobility ratio and its sign (positive and negative) for each protein-metal ion interaction have been successfully used to detect the interaction and estimate further coordination of the bound metal ion, respectively. Furthermore, the results were successfully discussed in view of the properties of the metal ions and proteins, and the HSAB concept as well. The comprehensive platform summarizes all the obtained interaction results, and is valuable for any future protein-metal ion investigation.
Schätzungsweise ein Drittel aller Proteine sind Metalloproteine, dies bedeutet, dass Metallionen für ihre biologische Funktion von Bedeutung sind. Somit ist die Untersuchung und Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Metallionen von Interesse. Einige Techniken können für diesen Zweck verwendet werden. Der Mobility-shift-Affinitätskapillarelektrophorese wurde gegenüber anderen Techniken der Vorzug gegeben, da sie kurze Analysenzeiten, Injektionen von geringen Probenvolumina (im Nanoliterbereich), hohe Trennungseffizienz, direkte Injektion von nicht aufgearbeitet Proben und die Möglichkeit unter physiologischen Bedingungen zu arbeiten vereint. Um das Einbinden einer Mobility-shift-Affinitätskapillarelektrophoresemethode in Routinebindungsstudien zu erleichtern, wurden eine Verkürzung der Analysendauer, der Methodentransfer und die Verbesserung der Präzision untersucht. Die Mobility-shift-Affinitätskapillarelektrophoresemethode wurde erfolgreich beschleunigt durch Verkürzen der Kapillare, Verwenden geringerer Probenkonzentrationen und geringerer Probenvolumina. Hierbei wurden kurze Analysezeiten von 4 Minuten erreicht. Die Präzision der Ergebnisse wurden durch ein leichtes Drücken der Probe in die Kapillare nach der Injektion, das Tauschen der Puffergefäße nach 30 Läufen, Einführen eines weiteren Spülschrittes nach 60 aufeinanderfolgenden Läufen und Verwendung von 0.1 M EDTA-Lösungen im Spülprotokoll verbessert. Diese verbesserte Mobility-shift-Affinitätskapillarelektrophoresemethode wurde erfolgreich verwendet um Interaktionsstudien zwischen Li+, Na+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Al3+, Ga3+, La3+, Pd2+, Ir3+, Ru3+, Rh3+, Pt2+, Pt4+, Os3+, Au3+, Au+, Ag+, Cu+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cr3+, V3+, MoO42- und SeO32- mit bovinem Serumalbumin, β-Lactoglobulin, humanem Serumalbumin, Myoglobin und Ovalbumin. Ausgezeichnete Präzision wurde für den Mobilitätsquotienten jeder Protein-Metallionen-Interaktion (RSD% von 0,05-1,0%, n > 324). Die berechnete, normalisierte Differenz der Mobilitätsquotienten und deren Vorzeichen (positiv und negativ) jeder Protein-Metalionen-Interaktion konnten erfolgreich verwendet werden um Interaktionen zu erkennen und die weitere Koordination der Metallionen abzuschätzen. Des Weiteren konnten die Ergebnisse in Hinblick auf die Eigenschaften der Metallionen und Proteine sowie des HSAB-Konzepts erfolgreich diskutiert werden. Die Gesamtübersicht fasst alle erhaltenen Interaktionsergebnisse zusammen und ist wertvoll für zukünftige Protein-Metallionenuntersuchungen.
Preview
Cite
Access Statistic
Rights
Use and reproduction:
All rights reserved