Metabolic characterisation of the nutritional versatile marine bacterium Phaeobacter inhibens DSM 17395 via gas chromatography – mass spectrometry
Heterotrophic marine bacteria are challenged by versatile and dynamic nutrient conditions, which fluctuate seasonally, as a result of bloom and collapse of algae populations. Due to such conditions, the Roseobacter clade is one of the most abundant and metabolically active bacteria clades in marine environments. In this thesis, mainly GC-MS-based metabolomic analyses were applied to study how the metabolism of Phaeobacter inhibens DSM 17395 is adapted to the nutrient conditions in marine habitats. Collected data were statistically evaluated and interpreted in the context of collaborative performed complementary analyses. Phenotypic microarray analysis revealed a broad substrate range for carbon and nitrogen sources. Accordingly, cultivation in complex medium led to depletion of most of the provided substrates. Under these cultivation conditions, high abundance of catabolic enzymes and the corresponding intermediates were observed, which revealed simultaneous utilisation of different substrates, especially amino acids. To analyse their utilisation in a detailed study, a defined casamino acid medium was used for a time-dynamic resolution. Although different amino acids were utilised simultaneously, a specific uptake preference was observed. Further, even though sufficient amino acids were still available, cells entered stationary phase. In contrast to this, strains cured from the 262 kbp plasmid showed enhanced growth. Thus, either regulatory factors or the tropodithietic acid biosynthesis, which are encoded on this plasmid, are responsible for growth inhibition. Based on the original genome annotation, some amino acid (Phe, Lys, His, Met, Leu, Ile, Val, Thr and Trp) and carbohydrate degradation pathways (N-acetyl-glucosamine, mannitol, sucrose and xylose) remained unclear. Metabolomic and proteomic analyses, which were conducted in this study, allowed reconstruction of these pathways. Further, these analyses showed that P. inhibens DSM 17395 is well adapted to catabolise efficiently single substrates. But replenishment of the TCA cycle for anabolism lacked efficiency, because of usage of the complex ethylmalonyl-CoA pathway. This pathway is widely distributed in the Roseobacter clade and could completely be reconstructed by proteomic and LC-MS-based coenzyme A analysis. Overall, this thesis revealed many new metabolic features, which explain the adaptation of P. inhibens DSM 17395 to marine habitats and improve our understanding of marine bacteria.
Heterotrophe Meeresbakterien müssen vielseitige und dynamische Nährstoffbedingungen bewältigen, die jahreszeitlichen Veränderungen unterliegen, infolge von Blühen und Zusammenbruch von Algenpopulationen. Daher ist die Roseobacter Klade eine der zahlreichsten und metabolisch aktivsten Bakteriengruppen im Meer. In dieser Arbeit wurde hauptsächlich mittels GC-MS-basierten Metabolomanalysen untersucht, wie der Stoffwechsel von P. inhibens DSM 17395 an Nährstoffbedingungen im Meer angepasst ist. Die erhaltenen Daten wurden statistisch ausgewertet und im Kontext von kollaborativ durchgeführten ergänzenden Analysen interpretiert. Mittels phänotypischer Microarray Analysen wurde ein breites Substrat Spektrum für Kohlenstoff- und Stickstoffquellen festgestellt. Daher führte die Kultivierung im Komplexmedium auch zum Verbrauch der meisten Substrate. Die Fülle der hierbei detektierten katabolischen Enzymen und Intermediaten zeigte eine simultane Verwertung verschiedener Substrate, insbesondere von Aminosäuren. Um deren Verwertung genauer zu untersuchen, wurde ein definiertes Medium mit Casaminosäuren für eine Zeit-dynamische Auflösung verwendet. Obwohl verschiedene Aminosäuren gleichzeitig verwendet wurden, wurde eine spezifische Aufnahmepräferenz beobachtet. Trotz noch ausreichend verfügbaren Aminosäuren, traten die Zellen in die stationäre Phase ein. Im Gegensatz dazu wurde bei Stämmen, denen das 262 kbp Plasmid entfernt wurde, erhöhtes Wachstum festgestellt. Daher sind entweder regulatorische Faktoren oder die Biosynthese der Tropodithiensäure, die auf diesem Plasmid kodiert sind, verantwortlich für die Wachstumshemmung. Basierend auf der Original Genomannotation, blieben einige Aminosäure und Kohlenhydratabbauwege unklar. Mithilfe von metabolomischen und proteomischen Analysen konnten diese Abbauwege rekonstruiert werden. Zudem konnte dabei gezeigt werden, dass P. inhibens DSM 17395 gut angepasst ist um individuelle Substrate effizient abzubauen. Allerdings wurde der Citratzyklus für anabolische Zwecke nicht effizient nachgefüllt, wegen der Verwendung des aufwendigen Ethylmalonyl-CoA Stoffwechselwegs. Dieser Stoffwechselweg ist weitverbreitet in der Roseobacter Klade und konnte durch proteomische und LC-MS basierte Coenzym A Analysen rekonstruiert werden. Insgesamt wurden in dieser Arbeit viele neue metabolische Besonderheiten aufgedeckt, die die Anpassung von P. inhibens DSM 17395 an marine Lebensräume erklären und unser Verständnis von Meeresbakterien erweitern.
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