Structural investigation of the bacterial amyloid adhesin Curli by solid state NMR

Schubeis, Tobias

doi:10.24355/dbbs.084-201412011054-0

Published

Structural investigation of the bacterial amyloid adhesin Curli by solid state NMR

English
German

CsgA is the major subunit of a bacterial functional amyloid called curli, expressed by enterobacteriaceae e.g. Escherichia coli. Curli is involved in formation of biofilms and host cell attachment. Amyloids of CsgA have been extensively studied in vivo as well as in vitro and provide a well-suited system for understanding the process of amyloid formation, propagation and control mechanism. High-resolution structure of functional amyloid fibrils is a prerequisite to gain insights into their functions, mechanism, and more importantly the differences between disease-related and functional amyloids. Solid state NMR was used to investigate CsgA amyloid fibrils. Since spectra of the uniformly labeled CsgA suffered from high spectral overlap due to the high degree of sequence and structure homology in CsgA, segmental labeling by protein-trans-splicing was utilized. Intein fusion pairs for the preparation of three differently labeled samples were established. Solid state NMR measurements on a sample with single labeled structural repeat enabled sequence specific assignments and first insights to the structure of CsgA. The proposed strand-loop-strand motive could be confirmed and distance restraints gave rise to a beta-strand swap within the amyloid fibril. The established strategy of segmental isotope labeling was additionally demonstrated on the structurally well characterized amyloid fibrils of HET-s (218-289). The obtained spectra did not show chemical shift deviations from a uniformly labeled sample and published data. The layer specific labeling pattern allowed the detection on unambiguously intermolecular distance restraints.

CsgA ist der Hauptbestandteil eines bakteriellen funktionellen Amyloids, genannt Curli, welches von Enterobakterien wie z.B. Escherichia coli exprimiert wird. Curli ist an der Bildung von Biofilmen und der Bindung an Wirtszellen beteiligt. CsgA amyloide wurden in vivo als auch in vitro ausgiebig untersucht und bilden ein geeignetes System um den Prozess der Amyloidbildung, Ausbreitung und deren Steuermechanismen zu studieren und zu verstehen. Hochaufgelöste Strukturen von Amyloiden sind die Voraussetzung um Einblicke in deren Funktion zu erlangen und vor allem um die Unterschiede zwischen krankheitsbedingten und funktionellen Amyloiden zu verstehen. Dazu wurden CsgA Fibrillen mittels Festkörper-NMR untersucht. Spektren von vollmarkierten Proben (13C, 15N) zeigten eine starke Resonanzüberlagerung aufgrund der intrinsischen Sequenz- und Strukturwiederholungen. Daher wurde eine Methode verwendet in der nur ein bestimmtes Teilstück des Proteins mit Isotopen markiert wird. Erreicht wird dies mit Hilfe von Intein katalysiertem Protein Spleißen. Dazu wurden verschiedene Intein-Fusionsproteine generiert um Proben mit unterschiedlichen Markierungsmustern zu erzeugen. Festkörper-NMR Messungen auf einer Probe mit einer einzelnen markierten strukturellen Wiederholung ermöglichten Sequenz spezifische Resonanzzuordnungen und erste Einblicke in die Struktur von CsgA. Das vermutete Strang-Schleife-Strang Motiv konnte bestätigt werden und Messungen von Abstandsbeschränkungen führten zu der Vermutung eines Beta-Strang-Austausches zwischen zwei aufeinanderfolgenden Molekülen innerhalb der Amyloidfibrillen. Die für CsgA etablierte Strategie der segmentalen Isotopenmarkierung wurde außerdem auf die strukturell gut charakterisierten Amyloidfibrillen von HET-s (218-289) angewandt. Die erhaltenen Spektren zeigten keine Abweichung der chemischen Verschiebung, weder im Vergleich zu einer vollmarkierten Probe noch zu publizierten Daten. Das Ebenen spezifische Markierungsmuster ermöglichte außerdem die Messung von eindeutig intramolekularen Abständen.