Strukturaufklärung von Komponenten des Curlibiogeneseapparates aus Escherichia coli
Als Teil der extrazellulären Matrix werden Curlifimbrien von verschiedenen Enterobakterien, wie Escherichia coli oder Salmonella spp. gebildet und spielen eine wichtige Rolle in der Biofilmbildung sowie bei der Anheftung an Wirtszellen oder abiotische Oberflächen. Durch extrazelluläre Nukleation und Präzipitation polymerisieren die Curliuntereinheiten CsgA und CsgB zu einem funktionalen Amyloid. An diesem Prozess sind zusätzlich das periplasmatische Protein CsgE, das extrazelluläre Protein CsgF und die Membranpore CsgG beteiligt. Für CsgE wurden zuvor eine chaperon-ähnliche Funktion und eine Rolle als Porenverschuss vorgeschlagen. CsgF ist wahrscheinlich in die Curlinukleation involviert und darüber hinaus essenziell für eine membranassoziierte Curlibildung. In dieser Arbeit wird die Lösungsstruktur von CsgE präsentiert, welche ein ßaßßßa-Faltungsmotiv und ein oberflächenexponiertes, aromatisches Cluster zeigt, aber keine Homologie zu bekannten Chaperonen oder Porenverschlussdomänen besitzt. Die Mutationen W69S und F88S im aromatischen Cluster von CsgE verringern, ohne Änderung der Gesamtstruktur, die Selbstassoziation des Proteins, wobei die Bindung an CsgA und CsgG in vitro erhalten bleibt. Zusätzlich konnte durch Lösungs-NMR eine Bindungsstelle von CsgA entlang einer hydrophoben Oberflächenfurche auf CsgE identifiziert werden. CsgE verlangsamt die CsgA-Autoaggregation in vitro, wobei es zur Coaggregation beider Proteine kommt. CsgE F88S kann die Curlibiogenese in vivo nicht komplementieren und deutet damit eine Rolle dieses Proteinbereichs in der Porenregulation an. Außerdem wird die Lösungsstruktur von CsgF in DHPC-Mizellen präsentiert, welche eine Dreidomänenstruktur aufweist. Auf eine N-terminale flexible Domäne mit potentiellem CsgG-Transportsignal folgt eine teilhydrophobe a-Helix, die möglicherweise in die Membraninteraktion involviert ist. Ein viersträngiges, antiparalleles ß-Faltblatt am C-Terminus stellt eine mögliche Plattform für die Bindung von CsgB dar, essenziell für eine membranassoziierte Curlinukleation. Die Strukturen von CsgE und CsgF liefern erste molekulare Details über deren Funktion und die strukturelle Grundlage für zukünftige Studien.
Curli fimbria are produced by different Enterobacteria, like Escherichia coli or Salmonella spp., as part of their extracellular matrix. Those fibers play an important role in biofilm formation and for the attachment to host cells or abiotic surfaces. The Curli subunits are assembled into a functional amyloid by an extracellular precipitation and nucleation mechanism. This process involves specific assembly factors, like the periplasmic protein CsgE, the extracellular protein CsgF and the transmembrane pore CsgG. For CsgE previous studies suggested a chaperone-like function and a role as plug for the CsgG pore. CsgF is probably involved in the nucleation process and was shown to be essential for the formation of membrane associated Curli. In this study the solution structure of CsgE is presented, which shows a ßaßßßa-fold and contains a surface-exposed aromatic cluster. CsgE has no homology to known chaperones or plug domains. CsgE variants with mutations like W69S or CsgE F88S in the aromatic cluster still interacted with CsgA and CsgG but showed a decreased CsgE self-association, without influencing the overall protein structure. Mapping the CsgA/CsgE interaction site by solution NMR revealed that a hydrophobic groove on CsgE is involved. CsgE/CsgA interaction retarded the CsgA autoaggregation but also induced an unexpected coaggregation. CsgE F88S could not complement the Curli formation in a ?csgE mutant in vivo and disclosed thereby an important role for the loop around F88 in export regulation. In addition the solution structure of CsgF in DHPC micelles is presented, which shows three distinct domains. An N-terminal flexible domain containing the potential CsgG-specific export sequence is followed by a semihydrophobic helix which could be involved in membrane interaction. At the C-terminus an antiparallel ß-sheet containing four ß-strands could be the platform for the interaction with CsgB, which in turn is essential for a membrane associated nucleation of Curli. The structures of CsgE and CsgF show first molecular details for their function and are the basis of further investigations.
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