Charakterisierung der zellassoziierten Phospholipase A PlaB aus Legionella pneumophila, das erste beschriebene Mitglied einer neuen Lipasefamilie

Legionella pneumophila verfügt über eine Vielzahl an Phospholipasen. Ein Vertreter der Phospholipasen A ist PlaB, das erste charakterisierte Mitglied einer neuen Lipasefamilie, welches sowohl hämolytische als auch Phospholipase A/Lysophospholipase A-Aktivitäten aufweist. Neben dem katalytisch aktiven Zentrum im N-terminalen Bereich besitzt PlaB eine C-terminale Region von etwa 170 Aminosäuren mit unbekannter Funktion. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bedeutung des C-Terminus näher analysiert. Es zeigte sich, dass jede einzelne polare Aminosäure innerhalb der letzten 15 Aminosäuren zur enzymatischen Aktivität von PlaB beiträgt. Mittels Zufallsmutagenese konnten 22 neue Aminosäuren identifiziert werden, deren Mutation einen Einfluss auf die Phospholipase A-Aktivität von PlaB bewirkt. Die erstmalige Reinigung von löslichem und aktivem PlaB ermöglichte die Generierung eines funktionellen PlaB-spezifischen Antikörpers. Strukturelle Analysen des gereinigten Strep-PlaB mittels Röntgenkleinwinkelstreuung, Größenausschlusschromatographie, chemischer Quervernetzung, Massenspektrometrie und analytischer Ultrazentrifugation ergaben, dass PlaB ein konzentrationsabhängiges Monomer-Dimer-Tetramer-Gleichgewicht ausbildet. Interessanterweise wies PlaB im nanomolaren Konzentrationsbereich, in welchem das Enzym als Monomer vorliegt, die stärkste spezifische Aktivität auf. Oberhalb von ~0,1 µM, wo PlaB als Dimer-Tetramer-Gleichgewicht existiert, war ein Rückgang der Aktivität zu beobachten. Bei Proteinkonzentrationen >5,4 µM, wo PlaB als Tetramer vorliegt, wurde keinerlei Aktivität festgestellt. Demnach assembliert sich PlaB im mikromolaren Konzentrationsbereich zum inaktiven Tetramer. Die Dissoziation des Komplexes bis hin zum Monomer im nanomolaren Konzentrationsbereich führt zur Aktivierung von PlaB. Diese konzentrationsabhängige Inaktivierung der PLA-Aktivität durch Tetramerisierung, stellt ein Mechanismus dar, welcher möglicherweise dem Selbstschutz von Legionella dient, wobei die Dissoziation des Enzyms seine Aktivierung nach dem Export erlauben könnte. Zelluläre Fraktionierungs-, Biotinylierungs- und Proteinase K-Zugänglichkeitsexperimente ergaben, dass PlaB als oberflächenassoziiertes Protein auf der äußeren Membran des Bakteriums lokalisiert ist. Allerdings ist das verantwortliche Sekretionssystem für den Export noch unbekannt. Sekretionsstudien mit N- und C-terminal verkürzten PlaB-Mutanten gaben jedoch Hinweise auf für die Translokation wichtige Proteinregionen.