Structural analysis of Bacterial and Viral Infections and a Cysteine Proteinase Legumain
Yersinia enterocolitica is one of the pathogenic bacteria that cause the foodborne disease called yersiniosis. Yersinia has two types of pyruvate kinases, YePykF and YePykA. Both PKs were crystallized alone and also co-crystallized with their allosteric effectors. The comparison between YePykF and YePykF+FBP complex structures revealed conformational changes on both allosteric site and active site. Upon F16BP binding, a loop region in allosteric site changes its conformation, and the B domain rotates towards the A domain by 14.6 degrees on average leading to a partial closure of the active site. YePykA structure was solved only in complex with AMP. Due to the low quality of the dataset, the AMP binding site remains unclear. Hepatitis C virus (HCV) is the major causative pathogen of acute and chronic liver diseases, liver cirrhosis, hepatocellular carcinoma and liver failure. The interaction between HCV envelope protein E2 and a scavenger receptor class B type I (SRB1) is considered necessary in the virus entry process. The structural analysis of E2 and SRB1 would provide valuable information for blocking the virus entry and hence control of the HCV infection. Both extracellular domains of E2 and SRB1 were cloned and expressed from different eukaryotic expression systems. The proteins transiently expressed with HEK 293 cells showed high aggregation due to misfolding. Later HCV sE2 was homogenously expressed from CHO lec 3.8.2.1 stable cell line. The purified sE2 was set up for crystallization, but no crystals were obtained. SRB1 ectodomain was homogenously expressed from insect cells, leading to protein of high purity. The cysteine protease legumain turned out to be a byproduct of HCV sE2 purification. CHO lec 3.8.2.1 is constitutively secreting prolegumain to the cell culture medium. Legumain is considered to be an asparaginyl endopeptidase because it specifically cleaves after asparagine at pH 5.8. Two prolegumain and one active legumain structures have been solved in this work. The high-resolution active legumain structure reveals a succinimide residue in the active site. The succinimide is cyclized from an aspartate residue, and not related to protein degradation. The structural study on legumain would provide valuable information for drug design and cancer vaccine development.
Yersinia enterocolitica ist eine der pathogenen Bakterien, die die durch Lebensmittel übertragene Krankheit Yersiniose verursachen. Die Untersuchung des Stoffwechselsystems von Yersinia enterocolitica wäre eine gute Strategie zur Kontrolle der Infektion. Der Vergleich zwischen den Strukturen von YePykF- und des YePykF+FBP-Komplexes offenbarte Konformationsänderungen sowohl am allosterischen wie am aktiven Zentrum. Bei F16BP-Bindung ändert eine Loop-Region des allosterischen Zentrums ihre Konformation und die B-Domäne dreht im Durchschnitt um 14,6 Grad in Richtung A-Domäne, was zu einer partiellen Schlieäung des aktiven Zentrums führt. Die YePykA-Struktur wurde nur im Komplex mit AMP aufgeklärt. Aufgrund der geringen Qualität des Datensatzes ist die AMP-Bindungsstelle noch nicht klar. Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist der Haupterreger von akuten und chronischen Lebererkrankungen, Leberzirrhose, hepatozellulärem Karzinom und Leberversagen. Die Interaktion des HCV-Hüllproteins E2 und einem Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I (SRB1) wird als notwendig für den Prozess des Viruseintritts erachtet. Die Strukturuntersuchung von E2 und SRB1 würde wertvolle Informationen zur Blockierung des Viruseintritts und damit zur Kontrolle der HCV-Infektion liefern. Die extrazellulären Domänen von E2 und SRB1 wurden kloniert und aus verschiedenen eukaryontischen Expressionssystemen exprimiert. Die transient in HEK293-Zellen exprimierten Proteine zeigten eine hohe Aggregation aufgrund von Fehlfaltung. Später wurde HCV sE2 homogen aus einer stabilen CHO-lec 3.8.2.1 Zelllinie exprimiert. Das aufgereinigte SE2 wurde zur Kristallisation eingesetzt, es konnte jedoch kein Kristall gewonnen werden. Etwa zur gleichen Zeit wie diese Experimente wurden zwei E2-Kernstrukturen ohne die hypervariablen Regionen veräffentlicht. CHO-lec 3.8.2.1 gibt Prolegumain konstitutiv ins Zellkulturmedium ab. Legumain gilt als eine Asparaginyl-Endopeptidase, weil es bei pH 5,8 spezifisch nach Asparagin spaltet. Man geht davon aus, dass Säugerlegumain in der Immunität, Signaltransduktion, Knochenresorption und Tumorwachstum/Metastasierung eine Rolle spielt. Zwei Prolegumain-Strukturen und eine aktive Legumain-Struktur wurden in dieser Untersuchung aufgeklärt. Die hochaufgeläste Struktur von aktivem Legumain zeigt einen Succinimidrest im aktiven Zentrum. Das Succinimid wird aus einem Aspartatrest zyklisiert und hängt nicht mit Proteinabbau zusammen.
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