Analysis of antibiotic resistance determinants in Pseudomonas aeruginosa – a transcriptomic approach
During this work, a Pseudomonas aeruginosa optimized, strand-specific RNA-sequencing method was developed to allow for multiplexed transcriptome data acquisition on Illumina next generation sequencing systems. This technique was used to obtain global sequence and expression information from 149 clinical isolates of different sample origins and with diverse antibiotic resistance profiles (most of them multidrug resistant). The received fraction of up to 75 % mapped mRNA reads per sample, resulting in up to 90 % total genome coverage, was sufficient for in depth data analysis at the single nucleotide level. This data was successfully used to determine high resolution taxonomic relatedness of the isolates and screen for genetic determinants correlating with ß-lactam resistance phenotypes of phylogenetically unrelated strains. A combination of de novo assembly and coverage determination was used to search for acquired resistance genes and led to the identification of nine different ß-lactamases in overall 19 isolates. Furthermore, statistical comparisons were employed and integrated in a publically available database for the analysis of core genetic alteration enrichments (SNPs, stops, gene expression) in phenotypically related groups of isolates. Thereby, six genes of significance in ceftazidime and two in meropenem non-susceptible isolates were identified. Single gene investigation revealed that more than 95 % of the isolates harbored known, dominant genetic resistance determinants which, apart from acquired enzymes, were displayed by constitutive intrinsic ampC overexpression or lack of OprD porin. Furthermore, the effects of low-level sub-inhibitory concentrations of bactericidal antibiotics on the transcriptome of PA14 wild type cells were investigated, revealing a variety of specific responses (DNA repair, cell envelope modification, ribosome regulation), but also common ones as SOS response and the induction of denitrification pathways. These results could be connected to global metabolic reactions as a consequence of intracellular reactive oxygen stress. Using isotope labelling studies, we detected an enhanced biosynthesis of amino acids which are directly derived from tricarboxylic acid cycle dependent or closely related NAD+ and NADP+ dependent pathways. This suggests common impacts of low-level bactericidal antimicrobials on bacterial cellular systems, regardless of their chemical structure, with a likely connection to respiration hyperactivation.
Im Verlauf dieser Arbeit wurde eine für Pseudomonas aeruginosa optimierte, Strang-spezifische Sequenziermethode genutzt, um globale Sequenz- und Expressionsinformationen von 149 klinischen Isolaten unterschiedlicher geografischer Herkunft und variierender Antibiotikaresistenzprofile aufzunehmen. Mit einem Anteil von bis zu 75 % mRNA pro Probe konnte eine Gesamtgenomabdeckung von bis zu 90 % erzielt werden, welche ausreichend für detaillierte, sequenzspezifische Analysen auf Einzelnukleotidebene war. Diese Daten wurden dazu verwendet, die Verwandtschaftsbeziehungen der verschiedenen Isolate hoch-auflösend darzustellen und nach genetischen Markern zu suchen, welche in phylogenetisch nicht verwandten Stämmen in Zusammenhang mit ß-Lactam-Resistenz standen. Durch eine Kombination aus de novo assembly und Analyse der relativen Genabdeckung konnten insgesamt neun verschiedene erworbene ß-Lactamasen in zusammen 19 Isolaten detektiert werden. Des Weiteren wurden datenbankintegrierte Hilfsmittel für statistische Vergleiche entwickelt um die Anreicherungen genetischer Marker (SNPs, Stopps, Expressionsdifferenzen) in phänotypisch ähnlichen Gruppen von Isolaten zu ermöglichen. Hiermit konnten sechs signifikante Gene in Ceftazidim und zwei in Meropenem resistenten Isolaten identifiziert werden. Eine detaillierte Untersuchung ausgewählter Gene zeigte zudem, dass in über 95 % die jeweilige erworbene ß-Lactam-Resistenz auf bekannte Hauptmarker wie erworbenen Resistenzenzyme, eine Überexpression der intrinsischen ß-Lactamase ampC oder ein Fehlen des OprD porins zurückzuführen war. Weiterhin wurde der Effekt von geringen, sub-inhibitorischen Konzentrationen bakterizider Antibiotika auf Wildtyp Zellen untersucht. Hierbei konnten neben spezifischen transkriptionellen Anpassungen eine Reihe von globalen Stressadaptionen wie die Induktion der SOS Antwort und des Denitrifikationsstoffwechsels beobachtet werden, die vermutlich aufgrund erhöhter intrazellulärer Sauerstoffradikalkonzentrationen auftraten. Mit Hilfe von Isotopenmarkierungen konnte eine Verbindung zu globalen metabolischen Veränderungen aufgezeigt werden. Diese führten unabhängig vom eingesetzten Antibiotikum zu einer erhöhten Biosynthese von Aminosäuren, die in direkter Abhängigkeit zum Zitratzyklus oder nahe verwandten NAD+ und NADP+ bedingten Prozessen standen. Somit lässt sich eine Überstimulation der Atmungskette als unabhängige Stressantwort auf geringe Antibiotikakonzentrationen vermuten.
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