Zeit- und polarisationsaufgelöste Multiphotonenspektroskopie und Mikroskopie von biologisch relevanten   Molekülen

Herbrich, Sebastian

doi:10.24355/dbbs.084-201407021146-0

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Zeit- und polarisationsaufgelöste Multiphotonenspektroskopie und Mikroskopie von biologisch relevanten Molekülen

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Die vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung der Multiphotonenanregung in verschiedenen Bereichen zur Charakterisierung von biologisch relevanten Molekülen. Zunächst wurde die natürliche Fluoreszenz von Aspergillus Ochraceus charakterisiert. Anhand der spezifischen Fluoreszenzlebensdauern von NAD(P)H und Melanin konnten diese, unter Berücksichtigung der Apparatefunktion, unterschieden und anschließend ihre Anteile und Verteilung bildgebend dargestellt werden. Die Ergebnisse dieser Messungen deuten auf eine komplexe innere Organisation und Struktur der Pilzsporen hin. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedene Arten des Metabolismus in den Sporen geben muss, je nach den umgebenden Faktoren. Es kann dabei von einem Entwicklungs- und einem Überlebensmetabolismus gesprochen werden. Desweiteren entwickeln sich die Sporen individuell wobei ihre unterschiedliche Herkunft, in Form der verwendeten Nährböden, ein bedeutender Faktor ist. Zum anderen wurden mit Hilfe vollständiger Polarisationsexperimente diverse Moleküle, mit Hilfe der Theorie der molekularen Parameter nach Vasyutinskii, spektroskopisch charakterisiert. Dazu wurde ein typischer Aufbau zur Zweifarben-Zweiphotonenanregung benutzt, um die molekularen Parameter von DMQ, Indol, L-Tryptophan, D-Tryptophan, Boc-Trp-OH und NATA zu bestimmen. Der Aufbau sowie die Theorie der M-Parameter nach Vasyutinskii konnten mit Hilfe der Messungen an DMQ getestet und verifiziert werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Zweiphotonenanregung in diesem Fall bevorzugt (93 %) über die dzdz-Komponenten des Übergangsdipolmomentes des DMQs stattfindet. Zum ersten Mal konnten Indol, Tryptophan und weitere Tryptophanderivate, gelöst in Propylenglykol, mit Hilfe eines Femtosekundenlasers im Wellenlängenbereich von 280 nm bis 300 nm untersucht werden. Es wurden wichtige molekulare Größen wie die Fluoreszenzlebensdauer, die Rotationskorrelationszeit, die Anisotropie und die molekularen Parameter nach Vasyutinskii bestimmt.

The use of multiphoton excitation on the characterization of different biological molecules is shown in the current thesis. Using the technique of two-photon microscopy the intrinsic fluorescence of Aspergillus Ochraceus was investigated. The studies were focusing on the natural fluorophores NAD(P)H and melanin. Regarding the instrumental response function the fluorescence lifetimes of NAD(P)H and melanin were determined and used to differentiate between the two fluorophores. Afterwards the lifetimes were used to generate a fluorescence lifetime image and to determine the ratio of enzyme-bound to free NAD(P)H. The results reveal that there is a complex organization and structure inside the spores. Furthermore, the measurements indicate that there are two different kinds of metabolism depending on the surrounding conditions of the spores. Another point is the individual evolution of the spores depending on the agars they lived on. A further usage of multiphoton excitation are complete polarization experiments. The fluorescence of different molecules was investigated and the molecular parameters were determined. Therefore, a standard two-color-two-photon setup was used. DMQ, indole, L-tryptophan, D-tryptophan, Boc-Trp-OH and NATA were the molecules measured. Using DMQ verified the setup and the theory of the M-parameters. Furthermore, it was shown that the two-photon excitation preferably (93 %) occurs through the dzdz-components of the transition dipole moment which are parallel to the molecular long axis Z. For the first time indole, tryptophan and the other tryptophan derivatives were investigated with a femto second laser at the wavelength range from 280 nm to 300 nm. All the important values like the fluorescence lifetime, the rotational correlation time, the anisotropy and the molecular parameters were determined. The results are the fundament of future measurements on the dynamics of complex molecules like proteins.