Herstellung, Charakterisierung und in vivo Funktionsanalyse von Intrabodies gegen die Polysialyltransferasen ST8SiaII und ST8SiaIV

Das Neurale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) ist ein primär auf Nervenzellen exprimiertes Adhäsionsmolekül und am Aufbau des Nervensystems sowie der Gehirnentwicklung beteiligt. Darüber hinaus reguliert es die Plastizität von Geweben im adulten Organismus. Durch die im Golgi-Apparat exprimierten Polysialyltransferasen ST8SiaII und ST8SiaIV kann das NCAM mit Polysialinsäure, einem Polymer der 5-N-Acetylneuraminsäure, modifiziert werden, was zu einer Umkehr der adhäsiven Eigenschaften und zu veränderten Interaktionsmöglichkeiten führt. Diese Funktion ist essentiell während der Embryogenese und wird bei einigen Tumorvarianten reaktiviert, wodurch deren Metastasierung gefördert wird. Intrabodies sind intrazellulär exprimierte, rekombinante Antikörperfragmente und ermöglichen den knockdown ihres Zielantigens, indem es gebunden und die Translokation in sein natürliches Zellkompartiment verhindert wird. ER-Intrabodies werden im Endoplasmatischen Retikulum exprimiert und verankert. In dieser Arbeit wurden aus im Vorfeld generierten monoklonalen Antikörpern gegen die Polysialyltransferasen ER-Intrabodies hergestellt, welche die Polysialylierung des NCAM durch Retention der Transferasen im ER verhindern sollten. Als Ausgangsmaterial wurde die RNA aus Hybridomazellen verwendet, woraus die Sequenzen der variablen Domänen gewonnen wurden. Anschließend wurden diese per PCR zu einer scFv-Sequenz kombiniert und nach Klonierung in den Vektor pCMV/myc/ER als ER-Intrabodies exprimiert. Die Bindung der Intrabodies an die Polysialyltransferasen wurde durch ELISA und Immunpräzipitation überprüft und ihre Retention im ER mittels Immunfluoreszenz gezeigt. Die verminderte Expression von polysialyliertem NCAM auf der Zelloberfläche konnte mit Hilfe der Durchflusszytometrie und im Immunblot demonstriert werden. Im Anschluss wurde die Funktionalität der Intrabodies in vivo getestet. Dazu wurden Zellen des Rhabdomyosarkoms stabil mit den Intrabodies sowie einer Luziferase transfiziert und in einem bereits etablierten Tumor-Mausmodell mittels IVIS hinsichtlich ihres Metastasierungspotentials untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die durch den Einsatz der Intrabodies reduzierte Expression von polysialyliertem NCAM die Metastasierung verzögern kann.