Alanyl-phosphatidylglycerol-dependent lipid homeostasis in Pseudomonas aeruginosa

Institut für Mikrobiologie
Arendt, Wiebke

Bacteria are able to adapt their cell envelope to changing environmental conditions by modifying the membrane lipid phosphatidylglycerol (PG) with lysine or alanine. This modification is mediated by aminoacyl-phosphatidylglycerol (aaPG) synthases and confers resistance against several antimicrobial compounds. Most aaPG synthases are specific either for the lysyl-tRNA or the alanyl-tRNA substrate. To date, it is not clear if alanyl-PG and lysyl-PG provide complementary or differing functions in different bacteria. For this, strains of the gram negative model organism Pseudomonas aeruginosa with artificially altered aaPG contents were generated. Phenotype analyses revealed that the employed amino acid but also the overall level of aaPG in the membrane are of importance for the antimicrobial resistance of P. aeruginosa. In several gram negatives, aaPG synthases are encoded in an operon with a second protein. The function of this PA0919 protein from P. aeruginosa was investigated in this study. A PA0919 deficient P. aeruginosa strain exhibited an increased alanyl-PG content, a stationary growth phase phenotype and an increased susceptibility to specific antimicrobial compounds. PA0919 expression was found upregulated under acidic conditions by a specific promoter. The PA0919 protein was recombinantly produced. The analysis of its substrate specificity revealed that PA0919 accepts p nitrophenol esters of amino acids as artificial substrates. The in vitro hydrolysis of the native substrate alanyl-PG was observed and PA0919 was termed A PGH (alanyl-PG hydrolase). Analyses of site-directed mutant proteins and an inhibitor study indicated that the hydrolysis of alanyl-PG depends on the active site amino acid residues serine 307 and histidine 401 of the A-PGH. A localization study identified the A PGH in the inner membrane of P. aeruginosa. This investigation elucidated the regulatory circuit that maintains the alanyl PG dependent membrane lipid homeostasis in P. aeruginosa.

Bakterien passen ihre Zellhülle an sich ändernde Bedingungen durch die Modifikation des Membranlipids Phosphatidylglycerol (PG) mit Lysin oder Alanin an. Diese Reaktion wird durch Aminoacyl-Phosphatidylglycerol (AaPG) Synthasen vermittelt und führt zur Resistenz gegen verschiedene antimikrobielle Substanzen. Die meisten AaPG-Synthasen sind spezifisch für das Lysyl- oder das Alanyl-tRNA-Substrat. Bisher ist unklar, ob Alanyl-PG und Lysyl-PG komplementäre oder unterschiedliche Funktionen in verschiedenen Bakterien aufweisen. Daher wurden Stämme des Gram negativen Modellorganismus Pseudomonas aeruginosa mit artifiziell verändertem AaPG-Gehalt generiert. Phänotyp-Analysen zeigten, dass die zur PG-Modifikation verwendete Aminosäure und der AaPG-Gehalt der Membran für die Resistenz von P. aeruginosa wichtig sind. In Gram negativen Bakterien sind AaPG-Synthasen mit einem zweiten Protein in einem Operon kodiert. Die Funktion dieses Proteins PA0919 aus P. aeruginosa wurde untersucht. Ein PA0919-defizienter P. aeruginosa-Stamm wies einen erhöhten Alanyl-PG-Gehalt, einen Wachstumsphänotyp in der Stationärphase und eine erhöhte Suszeptibilität für spezifische antimikrobielle Substanzen auf. Die verstärkte Expression von PA0919 durch einen spezifischen Promotor wurde unter sauren Bedingungen beobachtet. Das Protein PA0919 wurde rekombinant produziert. Die Analyse seiner Substratspezifität zeigte, dass PA0919 p-Nitrophenol-Ester von Aminosäuren akzeptiert. Die Hydrolyse des nativen Substrates Alanyl-PG wurde in vitro beobachtet und PA0919 als A-PGH (Alanyl-PG Hydrolase) benannt. Analysen von ortsspezifischen Mutanten und eine Inhibitorstudie zeigten, dass die Alanyl-PG-Hydrolyse auf die Aminosäurereste Serin 307 und Histidin 401 der A-PGH zurückzuführen ist. Eine Lokalisierungsstudie identifizierte die A-PGH in der inneren Membran von P. aeruginosa. Diese Arbeit klärt den regulatorischen Kreislauf auf, der die Alanyl-PG-abhängige Membranlipid-Homöostase in P. aeruginosa bestimmt.


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