Entwicklung und Anwendung von superauflösender Fluoreszenzmikroskopie

Für eine drastische Erweiterung des Anwendungsfeldes der optischen Mikroskopie sorgte die in den letzten Jahren aufgekommene sogenannte Superauflösungsmikroskopie. Das klassische Modellsystem, um das Auflösungsvermögen derartiger Techniken zu vergleichen und zu quantifizieren, stellen Komponenten des eukaryontischen Zytoskeletts dar. Auch im Rahmen dieser Arbeit wurden derartige Zellstrukturen verwendet und anhand dessen ein quantitativer Wert für die Auflösung der Blink-Mikroskopie erhalten. Das System der Wahl waren dabei Aktinfilamente in vitro, in fixierten und in lebenden Zellen. Darüberhinaus wurde auch ein deutlich systematischerer Ansatz verfolgt, indem eine Matrix aus gezielt angeordneten Farbstoffmolekülen als Vergleichssystem verwendet wurde. Dabei wurde die gezielte Platzierung sowohl virtuell in Monte-Carlo-Simulationen, als auch real mithilfe eines Rasterkraftmikroskops durchgeführt. Die Platzierung von Farbstoffmolekülen durch die Verwendung von Rasterkraftmikroskopie wies allerdings einige Nachteile auf, wie etwa eine sehr aufwändige Durchführung und das Fehlen einer Möglichkeit zur Parallelisierung. Aus diesem Grund wurde im Folgenden auf die sogenannte DNA-Origami-Technik zurück gegriffen, um gezielte Farbstoffanordnungen zu generieren. Diese dienten nun als Testprobe sowohl für die Blink-Mikroskopie, als auch für die superauflösenden Techniken PAINT und SHRImP. Schließlich wurden DNA-Origamis als generelle Auflösungsstandards für die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie etabliert, wobei zur automatisierten Auswertung ein spezieller Algorithmus entwickelt wurde. Die Erweiterung auf den dreidimensionalen Fall gelang durch die Nutzung von Astigmatismus-basierter 3D-Lokalisierungsmikroskopie und die Verwendung einer speziell dafür designten dreidimensionalen DNA-Origami-Struktur. Die Möglichkeit einer unkomplizierten Auswertung wurde auch in diesem Fall durch die Entwicklung eines automatisierten Detektionsalgorithmus sichergestellt.