Untersuchungen zur Maturation der Cytochrom cd1 Nitritreduktase NirS aus Pseudomonas aeruginosa PAO1

Die Cytochrom cd1 Nitritreduktase NirS aus P. aeruginosa ist ein gut charakterisiertes Protein. Trotz der bekannten Eigenschaften ist wenig über die Biosynthese und nichts über den Einbau des essenziellen Kofaktors Häm d1 in die NirS bekannt. Diese Arbeit diente dazu, neue Erkenntnisse über die Rolle der Proteine NirF und NirN zu gewinnen. Zunächst wurden NirF und NirN aus P. aeruginosa in silico analysiert. Nachdem festgestellt wurde, dass NirF eine Lipoprotein-Signalsequenz besitzt, wurde die Assoziation des Proteins an der inneren Membran von P. aeruginosa durch isopyknische Saccharose-Gradientenzentrifugation und Western-Blot-Analysen bewiesen In dieser Arbeit konnte erstmals eine Häm d1-freie NirS in E. coli produziert und gereinigt werden. Das hochreine Protein konnte zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern eingesetzt werden, die in Western-Blot-Analysen, Immunopräzipitationen und Immunoaffinitätsreinigungen zum Einsatz kamen. NirN konnte gereinigt werden und spezifische Antikörper gegen NirN erzeugt werden. Diese Antikörper wurden ebenfalls in verschiedenen Experimenten erfolgreich eingesetzt. In einer Reihe von Interaktionsexperimenten zwischen NirN und NirS konnte erstmals ein Komplex zwischen den Proteinen NirS und NirN nachgewiesen werden. Weiterhin zeigten diese Experimente und zusätzliche Pull-down-Analysen von NirF, dass dieses Protein ebenfalls an der Interaktion von NirN und NirS beteiligt ist und selbst mit diesen Proteinen interagiert. Abschließend wurde eine nirN-Deletionsmutante von P. aeruginosa daraufhin untersucht, ob NirN an der Häm d1-Biosynthese beteiligt sein kann. Dabei gab es erstmals Hinweise darauf, dass NirN am letzten Schritt der Häm d1-Biosynthese oder der Kofaktorinsertion in NirS beteiligt sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit trugen wesentlich zum besseren Verständnis der im Periplasma von P. aeruginosa ablaufenden Prozesse zur Nitritreduktase-Maturation bei. Zudem konnte ein neues NirS-Maturationsmodell postuliert werden.