Etablierung einer neuen Methode zur gerichteten Sequenzierung im Next Generation Sequencing von cDNA-Banken

Um DNA mittels 454-Technologie sequenzieren zu können, muss sie von Adaptersequenzen flankiert sein. Diese werden entweder über Random-Ligation eingeführt, oder mittels PCR heranamplifiziert (454-Amplicon-Library). Letzteres ermöglicht als einziges eine gerichtete Sequenzierung Target-spezifischer Bereiche. Die Herstellung einer 454-Amplicon Library nach bestehenden Protokollen hat einige Mängel: (i) die Adaptersequenzen werden als bis zu 40 Basenpaar lange Overhangs an den 5‘-Enden der Primer eingeführt; (ii) die Primer können Längen von über 60 Basenpaare haben; (iii) die Adaptersequenzen selber können inkompatibel mit Target-spezifischen Sequenzen sein. In dieser Arbeit wurden neue Protokolle zur gerichteten Sequenzierung entwickelt, die auch dann erfolgreich anwendbar sind, wenn bestehende Protokolle scheitern. Die entwickelte Methodik beruht auf gerichteter Ligation von 454-Adaptersequenzen über die Verwendung von unterschiedlichen SfiI-Restriktions-Schnittstellen. Diese können während der cDNA-Synthese in das Template eingeführt, oder unabhängig davon mittels PCR als kurze Overhangs heranamplifiziert werden. Template- und 454-Library-Produktion wurden entkoppelt, wodurch man unabhängig von Template-Sequenzen und verwendeten Primern ist. Die Gestaltung von Multiplex-Runs ist flexibler und die MID-Wahl kann zeitnah durchgeführt werden. Die Sequenzierrichtung kann frei gewählt werden, womit eine optimale Anpassung an biologische Fragestellungen und effektive Ausnutzung der PTP ermöglicht wird. Das Protokoll ist leicht adaptierbar und funktioniert prinzipiell mit jeglichem Template. Aufreinigungs- und Größenselektionsschritte garantieren eine hohe Qualität. Die benötigten Template-Mengen konnten gemessen an den Standard-Protokollen auf weniger als ein Zehntel reduziert werden; 10 ng DNA sind ausreichend. Es wurden erfolgreiche 454-Sequenzier-Läufe von cDNAs und einer Illumina-Library durchgeführt, außerdem wurde ein Deepsequencing von IgH-cDNAs ermöglicht.