Systems Biotechnology of Pseudomonas putida for the enhanced production of Polyhydroxyalkanoates  : a rational approach for strain and bioprocess engineering

Die Produktion von Kunststoffen aus Erdöl ist mit erheblichen Umweltproblemen verbunden. Darüber hinaus stellt sich die Frage nach der zukünftigen Verfügbarkeit des nicht erneuerbaren Rohstoffs. Während der letzten 30 Jahre haben sich Polyhydroxyalkanoate (PHA) als nachhaltige Alternative zu Erdöl-basierten Produkten durchgesetzt. Im Gegensatz zu synthetischen Kunststoffen haben diese Biopolymere den Vorzug, dass ihre chemische Zusammensetzung sie biokompatibel und zugänglich für Biodegradation macht. Als Teil des natürlichen Kohlenstoffzyklus ist ihre Verwendung CO2-neutral. Trotz einer enormen Wissensbasis über die Synthese umweltfreundlicher Biopolymere ist die industrielle Produktion von PHA immer noch fünf bis zehnmal teurer als die herkömmlicher Kunststoffe. Die vorliegende Arbeit widmet sich diesem wichtigen Thema mit dem Ziel die Produktionsrate von PHAs durch einen systembiotechnologischen Ansatz in Pseudomonas putida als Zellfabrik zu steigern. Zunächst wurde gezeigt, dass lebende Zellen von P. putida und verwandter Spezies als Biokatalysatoren für die Herstellung verschiedener industriell relevanter Grundstoffe geeignet sind. Während kontinuierlicher Kultivierungen in der kontrollierten Umgebung eines Chemostats wurde der Einfluss verschiedener Nährstoff-Limitierungen auf den Stamm P. putida KT2442 sowie dessen Produktion von PHA untersucht. Unter strikter Stickstoff-Limitierung wurden die höchsten PHA-Konzentrationen erreicht, die bisher in kontinuierlichen Kulturen gemessen wurden. Um einen Einblick in die Biosynthese von PHA unter verschiedenen limitierenden Bedingungen zu erhalten, wurden Transkriptom-, Proteom- und Metabolom-Studien durchgeführt. Gleichzeitige Stickstoff- und Kohlenstoff-Limitierung zeigte dabei im Vergleich zu den einzelnen Limitierungen ein stark unterschiedliches Expressionsprofil. Unter den zellulären Komponenten, die am stärksten durch die Nährstoff-Limitierungen beeinflusst waren fanden sich der Energie-Metabolismus, der Fettsäure-Metabolismus, die Stressantwort sowie Bestandteile des Transportsystems. Mit Hilfe des Systembiologischen Ansatzes war es möglich, die PHA Biosynthese unter beiden Limitierungen zu erhöhen. Unter dieser Bedingung wurde die Kohlenstoffquelle am effizientesten und ökonomischsten genutzt. Um die Produktionskosten für PHA weiter zu minimieren, wurden P. putida KT2440 und in silco abgeleitete Stämme unter Bedingungen kultiviert, die eine PHA-Produktion mit der kostengünstigen Kohlenstoffquelle Glukose begünstigen. Der Stamm mit einer Δgcd-Mutation zeigte eine um 60% erhöhte PHA-Akkumulation im Vergleich zum Wildtyp-Stamm. Dabei zeigte dieser Stamm eine hohe spezifische Wachstumsrate und ein Genexpressionsprofil, das durch die Mutation kaum beeinflusst wurde. Um die PHA-Produktion im Industrie-Maßstab weiterzuentwickeln wurde die P. putida-Stämme mit der Methode der Wahl aus der Industrie kultiviert – dem "Fed-batch Process". Nach der Anwendung eines exponentiellen Fütterungsansatzes, um die Bildung von Biomasse zu optimieren sollte die Bildung von PHA über eine gepulste statt lineare Fütterungsstrategie angeregt werden. Diese stellte sich während der Hochdichte-Zellkultivierung als wesentlich geeigneter für die maximale PHA-Biosynthese heraus. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Resultate die Stärke von in silco basierten Methoden der Integration von "Omics"-Daten und Modellierung für die Optimierung von Stämmen für die Biosynthese von polyhydroxyalkanoaten.