Molekularbiologische und mikrobielle Studien zur enzymatischen Spaltung von Fucoidan
Das sulfatierte Polysaccharid Fucoidan, das aus Braunalgen extrahiert werden kann, besitzt einige interessante Bioaktivitäten. Es besteht hauptsächlich aus Fucose-Molekülen, die alpha-1,3 oder alpha-1,4-verknüpft und an den Positionen C2 bzw. C4 sulfatiert und teilweise mit weiteren Monosacchariden funktionalisiert sind. Da es Hinweise in der Literatur gibt, dass auch sulfatierte Fucoidanabbauprodukte Bioaktivitäten zeigen, werden Enzyme benötigt, die natives Fucoidan spalten. Für die Hydrolyse wurde in der vorliegenden Arbeit als erstes die endo-spaltende Fucoidanase FcnA, die Fucoidan aus den Algen Pelvetia canaliculata und Ascophyllum nodosum spaltet, aus dem Bakterium Mariniflexile fucanivorans kloniert und rekombinant exprimiert. Der zweite Ansatz war, aus marinen Proben, die in Wilhelmshaven (Nordsee) genommen wurden, Bakterien zu isolieren, die Fucoidan abbauen können. Die Anreicherung erfolgte auf einem Nährmedium, dem das Polymer zugesetzt wurde. Unter den Isolaten, die hierbei positiv auffielen, befand sich das Bakterium MW-C3, das neben anderen Kohlenhydraten Fucoidan von Fucus vesiculosus als einzige Kohlenstoffquelle verwerten konnte. Die Charakterisierung von MW-C3 ergab, dass es sich um eine neue Art bzw. Gattung innerhalb der Familie der Flavobacteriaceae handelt. Die Übereinstimmung der Sequenzidentität der 16S rDNA lag bei weniger als 93 % zu bekannten Gattungen (Tenacibaculum und Polaribacter). Das Bakterium MW-C3 zeigte die extrazelluläre Aktivität, Fucoidan in Oligosaccharide zu spalten, was durch die Zunahmen von niedermolekularen Polymerabbauprodukten in einer sogenannten Carbohydrate-PAGE nachgewiesen wurde. Nach zahlreichen Schüttelkultur-Versuchen wurde MW-C3 in einem 3 l-Bioreaktor Maßstab kultiviert. Die anschließende Aufarbeitung des Kulturüberstands führte zu einer Enzymlösung, die für die enzymatische Spaltung von Fucoidan aus Fucus vesiculosus eingesetzt wurde.
The sulphated polysaccharide fucoidan, which can be extracted from brown algae, exhibits numerous interesting bioactivities. It mainly consists of fucose molecules, which are alpha-1,3 and alpha-1,4 linked and substituted with sulphate groups at position C2 and C4 and partially functionalized with further monosaccharides. Because evidence in literature assumes, that even sulphated degradation products show bioactivities, enzymes, that are capable to cleave native fucoidan are needed. Therefore the alga Fucus vesiculosus (bladder wrack) was collected at the shore in Wilhelmshaven (North Sea) and Fucoidan was extracted for the purpose of enzymatic hydrolysis. The first approach in the work at hand was to clone and recombinantly express the endo-active fucoidanase FcnA from the bacterium Mariniflexile fucanivorans, that hydrolyses fucoidan from Pelvetia canaliculata and Ascophyllum nodosum. Additionally marine samples taken from the shore at Wilhelmshaven (North Sea) were used to isolate bacteria, which were able to degrade fucoidan. The enrichment was performed with medium containing the polymer as supplement. Among the isolates that positively stood out was MW-C3, which was able to grow on fucoidan from Fucus vesiculosus as sole carbon source, but not on fucoidan from Laminaria digitata. The characterization of MW-C3 concluded that this strain might be a new species or rather a new genus within the family of Flavobacteriaceae. The sequence identity of the 16S rDNA was less than 93 % to known genera (Tenacibaculum and Polaribacter). The bacterium MW-C3 showed an extracellular activity to cleave fucoidan into oligosaccharides of heterologous size, which was verified by the so-called Carbohydrate-PAGE . After experiments in shaking flask scale, MW-C3 was cultivated in a 3 l-bioreactor scale. The subsequent concentration of the cultivation supernatant resulted in an enzyme solution, which was employed for the enzymatic cleavage of fucoidan from Fucus vesiculosus.
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