Ultrasonic methods for analytical determination of pancreatic enzyme activities in pharmaceutical preparations
Ultrasonic Spectroscopy is a fast and automatable technique that uses acoustic waves of low power and high frequency propagating through a sample. Due to changes of density and compressibility of the substrate-enzyme-mixture, an enzyme reaction can be observed by monitoring the change of ultrasonic velocity over time. Enzyme activities can be determined relative to a reference standard. The goal of the present thesis was to test the technique as in-process control in view of Process Analytical Technology (PAT) and as an alternative method for the determination of enzyme activity in porcine pancreas powder and porcine pancreas-powder containing product. Ultrasonic Resonator Technology (URT, TF Instruments GmbH) and High Resolution Ultrasonic Spectroscopy (HR-US, Sonas Technologies Ltd.) were used to develop ultrasonic methods to determine amylase, lipase, protease (free and total) and free trypsin activities in pancreas powder and pancreas and pancreas powder-containing material. Repeatability was between 1.25 and 2.28 %. Selectivity of the methods was adequate for the determination of single enzyme activities in an enzyme mixture. The applicability as in-process control of proteolysis was tested by adding several substances to the sample matrix. Sodium chloride, calcium, isopropanol, protein (model: casein) and fat (model: olive oil) did not influence the enzyme activities in the developed methods, except for trypsin method which was disturbed by high isopropanol and fat content. Automation was tested by using a Flow-through System (FTS). Concerning API and drug product, the enzyme activities obtained with HR-US and URT were comparable with the results of the pharmacopoeia methods (Ph.Eur. and USP). Amylase, lipase and protease methods appeared to be applicable to in-process samples.
Hinter Ultraschallspektroskopie verbirgt sich eine schnelle und automatisierbare Technik, die Ultraschallwellen hoher Frequenz und geringer Intensität nutzt. Durch die Veränderung von Dichte und Kompressibilität des Substrat-Enzym-Gemisches kann eine Hydrolysereaktion über die zeitliche Veränderung der Ultraschallgeschwindigkeit verfolgt werden. Enzymaktivitäten können in Relation zu einem Referenzstandard bestimmt werden. Die Ultraschall-Technik wurde in Hinblick auf PAT (Process Analytical Technology) als Inprozesskontrolle und als alternative Freigabeanalytik zur Bestimmung von Enzymaktivitäten in Pankreaspulver und entsprechenden Produkten untersucht. Mit URT (Ultrasonic Resonator Technology, TF Instruments GmbH) und HR-US (High Resolution Ultrasonic Spectroscopy, Sonas Technologies Ltd.) wurden Methoden zur ultraspektroskopischen Bestimmung von Amylase-, Lipase-, freier und gesamter Protease- und freier Trypsinaktivitäten entwickelt. Die Wiederhol-Präzision lag zwischen 1,25 und 2,28 %. Die Selektivität der entwickelten Ultraschall-Methoden war ausreichend für die Bestimmung von einzelnen Enzymaktivitäten im Enzymgemisch. Inwiefern die Ultraschallspektroskopie auch als Inprozesskontrolle der Proteolyse genutzt werden kann, wurde durch den Zusatz verschiedenster Substanzen zur Probenmatrix untersucht. Natriumchlorid, Calcium, Isopropanol, Proteine (Casein als Modell) und Fett (Olivenöl als Modell) zeigten keinen störenden Einfluss auf die Methoden, die Trypsin-Methode wurde jedoch durch einen hohen Isopropanol- und Fett-Gehalt gestört. Automatisierbarkeit wurde durch den Gebrauch einer Durchflusszelle (FTS) untersucht. Für Wirkstoff und Produkt waren die mit HR-US und URT bestimmten Aktivitäten vergleichbar mit den Ergebnissen der Arzneibuchmethoden (Ph.Eur. und USP). Für die Amylase-, Lipase- sowie (freie und gesamte) Protease-Methoden scheint ebenfalls eine gute Anwendbarkeit für Inprozess-Muster gegeben zu sein.
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