Gentechnisches Enzymdesign zur Verbesserung der Eigenschaften von Isomaltulose-Synthase aus Protaminobacter rubrum

PalatinoseTM, ein Isomer der Saccharose, wird aufgrund seiner ernährungsphysiologischen Eigenschaften im industriellen Maßstab hergestellt. Palatinose wird durch die enzymatische Konversion aus Saccharose gewonnen. Eine kleine Gruppe von Palatinose-bildenden Bakterien besitzt das Enzym Isomaltulose-Synthase (PalI-Enzym), das für die Isomerisierung von Saccharose zu Palatinose verantwortlich ist. Bei dieser Reaktion entsteht neben Palatinose ein ganzes Spektrum an unerwünschten Nebenprodukten, deren Verhältnis nicht nur von Organismus zu Organismus, sondern auch in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen variiert. Der industrielle Prozess zur Herstellung von Palatinose ist weitestgehend optimiert, dennoch verteuern die Mengen der Nebenprodukte den Herstellungsprozess. Im Zuge des semirationalen Enzymdesigns konnten Zusammenhänge zwischen der Struktur und der Eigenschaft des PalI-Enzyms aus P. rubrum hergestellt werden. Hierbei wurde deutlich, dass vor allem ein Vergleich der PalI-Sequenzen aus eng verwandten Organismen eine Möglichkeit bietet, Positionen im palI-Gen zu finden, an denen sich eine Veränderung auf molekulargenetischer Ebene höchstwahrscheinlich auch auf die Eigenschaft des PalI-Enzyms auswirkt. Mit dem Austausch von 6 Aminosäuren N150H, K155Q, G166D, K171R, A173G und E175D gelang es, dem rekombinanten PalI-Enzym aus P. rubrum eine Thermostabilität bei 50 °C von mehreren Stunden zu verleihen. Diese neu gewonnene Enzym-Thermostabilität ist gleichzeitig mit einer drastischen Reduktion der spezifischen Aktivität des mutierten PalI-Enzyms verbunden. Die Substitution der einzelnen Aminosäure Arginin gegen Prolin an der Position 310 in dem rekombinanten PalI-Enzym aus P. rubrum führte zu einer Veränderung des Produktspektrums, ohne die maximale Palatinose-Menge zu verändern. Gleichzeitig ging mit dieser Punktmutation die Thermostabilität verloren.