Novel activity-based probes for functional analysis of deubiquitinating enzymes

Iphöfer, Alexander

doi:10.24355/dbbs.084-201205021132-0

Published

Novel activity-based probes for functional analysis of deubiquitinating enzymes

English
German

Ubiquitin ist ein kleines aus 76 Aminosäuren bestehendes Protein. Die Ubiquitinierung ist ein reversibler Prozess, wobei das Ubiquitin durch Deubiquitinierungs Enzyme entfernt wird. Demnach, sind DUBs ein Analogon zu Phosphotasen und funktionell ebenso wichtig wie Ligasen oder Kinasen und repräsentieren somit ein attraktives therapeutisches Ziel. Bedauerlicherweise ist der Mechanismus und die Funktion von DUBs nur wenig verstanden. Vielversprechend sind die Aktivität basierten Sonden (activity based probes -ABPs) dessen Aufbau ein modifiziertes Ubiquitin beinhaltet, welches am C-terminus eine reaktive Gruppe trägt. Bei der Anwendung dieser ABPs im funktionsbasierten Proteomiks Ansatz interagieren diese mit aktiven DUBs und binden kovalent an dessen katalytischen Aminosäurenrest. Ziel dieser Arbeit war es die Reaktivität der Sonden weiterhin zu verbessern und die fundamentale Frage der DUB Spezifität anhand neue entwickelter, spezifischer Sonden zu klären. Zusammengefasst, unter Verwendung des verbesserten Syntheseprotokolls ist es gelungen fünf neuartige ABPs (HAUb-VEE, HAUb-MVEE, HAUb-VA, HAUb-VFEA und HAUb-VF3EA) mit unterschiedlichen aktivitätsabhängigen DUB Bindungsprofilen zu synthetisieren. Das aktivitätsbasierte Profiling unter Verwendung des neuen hoch reaktiven HAUb-VFEA ermöglichte das detektieren von 63 aktiven DUBs in fünf verschiedenen Zelllinien (A549, EL-4, MCF-7, Jurkat E6-1 and HeLa S3). Eine weitere Intention war es eine neue Klasse von ABPs zu implementieren die es ermöglicht die DUBs Präferenz hinsichtilich der Ubiquitin- Verknüpfung in einem aktivitäts-basierten Assay zu profilen. Das Resultat war eine neue Art von reaktiven Ubiquitin-Peptid basierten Sonden (Ubiquitin Isopeptide Activity Based Probe (UIPP)). Zusammengefasst, die in dieser Arbeit neu entwickelten ABPs und UIPPs repräsentieren ein ideales Tool zur Anreicherung von aktiven DUBs und für die Charaktereisierung dessen Spezifität bezüglich Ubiquitinverknüpfungen.

Ubiquitin is a 76-amino-acid protein. The Ubiquitination is a reversible process, which is enabled by deubiquitinating enzymes (DUBs) that remove the ubiquitin. Therefore, DUBs have an analogous role to phosphatases and are functionally as important as ligases or kinases, thus representing an attractive therapeutic target. Unfortunately, the mechanism and function of DUBs are poorly understood. Useful tools termed activity-based probes (ABPs) are implemented by conversion of ubiquitin into a suicide substrate, which possesses a C-terminal reactive group. By utilizing the ABPs in a functional proteomics approach, these probes interact and bind covalently to the catalytic residue of active DUBs. The aim of this study was the improvement of the ubiquitin ABP by generating specific probes to clarify DUB linkage and substrate specificity issues. To conclude, using the improved synthesis protocol, it was possible to design and synthesize a set of five new ABPs (HAUb-VEE, HAUb-MVEE, HAUb-VA, HAUb-VFEA and HAUb-VF3EA), showing distinct activity-based DUB labeling profiles. The activity-based protein profiling using the most reactive probe (HAUb-VFEA) designed in this study revealed an overall of 67 active DUBs in five different cell lines (A549, EL-4, MCF-7, Jurkat E6-1 and HeLa S3). The next intention was to develop a new class of ABPs for characterization of the Ub-linkage preference of DUBs within the activity profiling assay. The result was novel peptide branched Ubiquitin Isopeptide Activity Based Probes (UIPPs). In conclusion, the ABPs and UIPPs created in this study were found to be enabling tools to capture active DUBs and study their selectivity towards ubiquitin-linkage specificity.