Development of inhibitory peptides against the NS2-3 and NS3/4A proteases of the Hepatitis C Virus

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung inhibitorischer Peptide gegen die NS2-3 und NS3/4A Proteasen des Hepatitis C Virus (HCV), die als Ausgangspunkt fr die Entwicklung von Medikamenten dienen k”nnen. Die HCV Proteasen sind essentiell fr den Lebenszyklus des Virus und daher interessante Ziele fr die Entwicklung neuer spezifischer Medikamente. Weltweit sind bis 170 Millionen Menschen chronisch mit HCV infiziert (Yu und Chiang, 2010). HCV Infektionen sind der Hauptgrund fr chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom (Shepard, 2005). Die Standardbehandlung erreicht nur in ungef„hr der H„lfte der behandelten Patienten eine dauerhafte Eliminierung des Virus und ist verbunden mit zahlreichen Nebenwirkungen(Manns et al, 2001). 2011 wurden zwei NS3/4A Protease-Inhibitoren zur Behandlung von HCV zugelassen (Klein und Struble, 2011; Poordad, 2011). Da der Virus schnell Resistenzen gegen diese Inhibitoren entwickelt, ist nur eine Anwendung mit der ursprnglichen Therapie m”glich, die starke Nebenwirkungen hat. Daher besteht noch immer ein groáer Bedarf an neuen Medikamenten fr eine Behandlung, die die Standardbehandlung ersetzen k”nnen. Groáe Peptide k”nnten alternative Bindungsmechanismen bieten, verglichen mit den Kleinmolekl-Inhibitoren in Entwicklung. Dies k”nnte Bindung an alternative Stellen sein und/oder Peptide werden m”glicherweise wegen ihrer groáen Bindungsoberfl„che weniger stark von HCV Resistenzmutationen beeintr„chtigt. In dieser Arbeit wurde die Phagen Display Peptid Bibliothek CPL19YS-2, die groáe Peptide pr„sentiert, fr iterative Affinit„tsanreicherungen verwendet. Die NS2-3 Protease konnte in einer Form produziert werden, die 50% Selbstspaltungs-Aktivit„t aufwies. Mittels Affinit„tsanreicherung konnten zwei Peptide identifiziert werden, die spezifische Affinit„t fr die NS2-3 Protease zeigen. Ein Peptid reduziert bei einer Konzentration von 270 nM die Aktivit„t der Protease auf 70%, wahrscheinlich durch Verhinderung der Dimer-Bildung. Dies ist ein erster Hinweis auf eine direkte Wirkung auf die Aktivit„t der Protease, die aber noch weitergehend untersucht werden muss. Die NS3/4A Protease wurde als Fusionsprotein produziert, bei dem die NS3 Protease Dom„ne mit dem NS4A Kofaktor verbunden wurde (Dimasi et al., 1998). Eine zus„tzliche Fusion mit dem MBP Protein verbesserte die L”slichkeit der Protease erheblich. Mittels Affinit„tsanreicherung konnten zwei Peptide identifiziert werden, die die NS3/4A Protease bei Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich inhibieren. Rekombination der Peptide mit pre-selektierten Peptiden fhrte zu Varianten mit verbesserter Affinit„t. Eine Variante zeigte eine zweifache Verbesserung des Ki Wertes auf 5,2 nM. Fr die weitere Verbesserung des N-terminalen Bereichs des Peptids wurden R”ntgenkristallographie und Strukturmodellierung erfolgreich eingesetzt. Die Ko-Kristallisation zeigte, dass das Peptid das aktive Zentrum der Protease verdeckt und das die Spaltung des Peptids durch geometrische Beschr„nkungen und Inhibierung des ?oxyanion hole? verhindert wird. Anhand des Modells vorgeschlagene ionische Interaktionen, die denen des natrlichen Substrats „hneln, konnten die Affinit„t des Peptids 10-fach auf einen Ki Wert von 530 pM verbessern. Das optimierte Peptid zeigte nur eine geringe Anf„lligkeit fr die A156V Resistenzmutation der NS3/4A Protease, die starke Resistenz gegen Kleinmolekl-Inhibitoren bewirkt. Dies ist ein erster Anhaltspunkt dafr, dass groáe Peptide weniger stark von Resistenzmutationen beeintr„chtigt sind. Inhibition von viraler Replikation in Zellkultur konnte mittels Fusion an das zellpenetrierende Peptid Antp gezeigt werden. Die Wirksamkeit des Peptids war ca. 30-fach verringert, aber es ist ein erster viel versprechender Befund fr eine intrazellul„re inhibitorische Wirkung.