Minicircles als multifunktionelle Werkzeuge zur Erweiterung der transienten Genexpression in Säugerzelllinien
Die transiente Genexpression (TGE) ist eine industriell an Bedeutung zunehmende Methode, Proteine in kürzester Zeit in Säugerzellen zu produzieren. Ihr umfangreicher Einsatz ist jedoch durch eine zumeist rapide Abnahme der Transgenexpression eingeschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein transienter Ansatz unter Verwendung von Scaffold / Matrix Attachment Regions (S/MARs) und minimalen, nicht-viralen Vektorsystemen (Minicircles) im Vergleich zu pEpi-basierten Parentalplasmiden in HEK293-Zellen getestet. Die verwendeten S/MAR-Elemente waren die etablierte M18-S/MAR (Broll et al., 2010) und eine neuartige Sequenz („CMV-S/MAR“; Wirth, M., unpublished), die im Rahmen dieser Arbeit eindeutig als S/MAR identifiziert werden konnte. Die TGE wurde darüber hinaus unter Verwendung kommerziell erhältlicher Plasmide analysiert. Für beide S/MAR-Elemente (M18 und CMV) wurde eine spezifische, transiente Expressionssteigerung in Minicircles gegenüber den entsprechenden Parentalplasmiden nachgewiesen (S/MAR-Minicircle- bzw. SMC-Effekt), wobei die Wirkung der beiden S/MARs unterschiedlich war. Darüber hinaus führte das Einführen zweier CMV-S/MAR-Elemente in pCMV-GLuc-Konstrukten zu einer relativen Steigerung der TGE um etwa dreihundert Prozent. Die in dieser Arbeit ermittelte transiente Aktivität von S/MAR-Elementen ist neu und unerwartet, eröffnet jedoch erweiterte (industrielle) Anwendungsmöglichkeiten für S/MAR-basierte Minicircles. Um den erhöhten DNA-Bedarf für die TGE auch bei der Verwendung von Minicircles decken zu können, wurde in dieser Arbeit der Flpe-basierte, sog. pAIO-Vektortyp entwickelt und das Produktionsprotokoll optimiert. Dies führte zu einer mindestens zehnfachen Steigerung der Minicircle-Ausbeute im Vergleich zu konventionellen Flp-basierten Methoden. Die auf diese Weise hergestellten Minicircles können durch minimale Veränderungen mit Flp-RMCE-Techniken kombiniert werden, was sie für die industrielle Anwendung interessant macht.
Transient gene expression (TGE) is a method with increasing industrial acceptation to produce proteins in a very short period of time in mammalian cells. Wide application, however, is limited by a rapid decrease of transgene expression. In the present work a transient approach of using scaffold / matrix attachment regions (S/MARs) and minimal, nonviral vector systems (minicircles) was tested in HEK293 cells and compared to pEpi-based parental plasmids. The S/MAR elements used here were the established M18-S/MAR (Broll et al., 2010) and a new sequence (‚CMV-S/MAR’; Wirth, M., unpublished), which could be clearly identified as an S/MAR in the course of the studies. In addition, TGE was analysed by using commercially available plasmids. With the use of both S/MAR elements (M18 and CMV) a specific increase of transient gene expression was shown in minicircles, compared to corresponding parental plasmids (S/MAR-minicircle- or SMC-effect), but both S/MARs revealed different properties. Furthermore, two CMV-S/MAR elements lead to a relative 300-percent increase of TGE in pCMV-GLuc-constructs. The transient activity of S/MAR elements, which could be identified in the present work, is new and unexpected. However, it opens advanced (industrial) application for S/MAR-based minicircles. To further meet the needs of increased minicircle DNA amounts for TGE a novel, Flpe-based, so-called pAIO vector type was developed in this work. The protocol for minicircle production was also optimized. This lead to an increase of minicircle yield of at least a factor ten, compared to conventional Flp-based methods. Minicircles that are produced in this way can be easily combined with Flp-RMCE techniques since they are based on the Flp recombinase system. Therefore they are potentially interesting for industrial application.
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