Structural Insights into Virulence Regulation in Yersiniae and Polyketide Synthase Systems
RovA is a central Regulator of Virulence genes in pathogenic Yersiniae In this work, the structure of RovA in complex with DNA was solved showing how RovA interacts with the DNA. The few specific interactions with the bases of the DNA explain how RovA can bind to several different binding sites in the bacterial genome. Several small molecules such as salicylate were found to bind to RovA. Additionally, the structure of RovA in complex with salicylate was solved. This showed two salicylate molecules bound per RovA monomer. Additionally, another protein from this regulatory network, RovM, was analysed biophysically in this work. It was possible to show that full length RovM is a tetramer in solution, whereas its effector binding domain (RovM-EBD) exists as a dimer. Furthermore, the structure of RovM-EBD was determined comprising two domains. A cavity was detected between the two domains that could bind a potential inducer molecule. The second topic of this thesis deals with the structural investigation of proteins involved in polyketide synthesis. The building blocks for this are often generated by dedicated enzymes, called crotonyl-CoA carboxylase/reductases (CCR). In this work, such an enzyme (CinF) that catalyses the conversion of octenoyl-CoA to hexyl-malonyl-CoA was analysed. The structure of CinF was solved in complex with its ligands NADP and octenoyl-CoA. It was possible to propose a reaction mechanism for this unusual carboxylation reaction and to determine amino acids that are involved in the selection of the substrate. Additionally, the thioesterase domain from the spirangien PKS biosynthesis cluster (SpirTE) was crystallized. The structure of SpirTE showed a substrate tunnel spanning the whole of the protein which harbours the active site in the middle. Compared to structures of TE domains which catalyse cyclisation SpirTE has a much more constricted substrate tunnel which could prevent the looping of the substrate and thereby its cyclisation.
RovA ist ein zentraler Regulator für die Virulenz in Yersinien, der z.B. die Expression des Adhesins Invasin aktiviert. In dieser Arbeit wurde die Struktur von RovA im Komplex mit DNA gelöst. Diese zeigt nur wenige basenspezifische Interaktionen. Dies erklärt wie RovA an unterschiedliche DNA-Sequenzen im Genom binden kann. Zudem wurde die Struktur von RovA im Komplex mit Salicylsäure gelöst, in der zwei Bindestellen für Salicylsäure pro Monomer RovA identifiziert werden konnten. Darüberhinaus wurde in dieser Arbeit RovM, ein weiteres Protein aus diesem Regulationsnetzwerk untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Effektorbindedomäne von RovM (RovM-EBD) in Lösung als Dimer vorliegt. Die Struktur von RovM-EBD wurde gelöst, welche aus zwei Domänen besteht. Zwischen diesen befindet sich eine Öffnung, in der möglicherweise ein Induktormolekül binden kann. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die Strukturaufklärung von Proteinen, die an der Synthese von Polyketiden beteiligt sind. Die Bausteine dafür werden oft von speziellen Enzymen, sogenannten Crotonyl-CoA Carboxylasen/Reduktasen (CCR), produziert. In dieser Arbeit wurde eine solches Enzym (CinF), das Hexylmalonyl-CoA produziert, untersucht. Die Struktur von CinF wurde im Komplex mit den Liganden NADP und Oktenoyl-CoA gelöst. So war es möglich, einen Reaktionsmechanismus zu postulieren und Aminosäuren zu bestimmen, die für die Auswahl der Substrate zuständig sind. Dadurch könnte es möglich werden, diese Proteine umzuprogrammieren, sodass sie andere Erweiterungseinheiten bereitstellen. Weiterhin wurde die Thioesterase-Domäne aus dem Spirangien PKS Biosyntheseweg (SpirTE) kristallisiert. Die Struktur von SpirTE zeigt einen Substrattunnel, der sich durch das ganze Protein zieht und in der Mitte das aktive Zentrum beherbergt. Verglichen mit anderen TE-Domänen ist dieser Tunnel deutlich schmaler, was verhindert, dass das Produkt zyklisiert.
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